ウエルシュ菌α毒素の新規受容体探索：ガングリオシドとの関係

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24590542
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 小田 真隆 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00412403)
• Keywords: ウエルシュ菌 / α毒素 / GM1a / TrkA / ホスホリパーゼC / ジアシルグリセロール / クラスター

Research Abstract

昨年度までの解析により，ウエルシュ菌α毒素は，細胞膜上のガングリオシドGM1aとチロシンキナーゼ関連受容体（TrkA）との複合体に結合すること世界で初めて明らかにし，J Biol Chemに報告した．
今年度は，α毒素による細胞膜リン脂質の変化がTrkAの活性化に重要な働きを演じているのではないかと仮説を立て，種々の蛍光色素，及び共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した．その結果，α毒素は，細胞膜上のGM1aに結合後，毒素自身が保有するホスホリパーゼC活性，及びTrkAの下流に存在する内因性ホスホリパーゼCγ-1の活性化により，ホスファチジルコリンがジアシルグリセロールへ分解され，このリン脂質の挙動変化によりTrkAのクラスター化が著しく亢進されていることが明らかとなった．TrkAのリガンドである神経成長因子では，このようなリン脂質代謝が認められないことから，α毒素の毒素たる所以は，リン脂質代謝によるシグナルの撹乱であると推察された．
また，今年度は，α毒素が有するガングリオシド結合モチーフ（H＿＿＿SWY＿＿＿G）のどの部位とGM1aが結合しているかを解析するため，モチーフ内の8個のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した8種類の変異毒素を作成し，GM1a含有リポソームへの結合実験をBIACORE3000で解析した．その結果，α毒素の84位トリプトファン残基と85位チロシン残基がGM1aとの相互作用に重要であることが判明した．

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

α毒素は，細胞内ホスホリパーゼC活性を亢進し，様々な毒性（溶血，活性酸素産生，サイトカインやケモカイン酸性）を発現していると報告してきた．しかしながら，その活性化メカニズム，及びそのアイソタイプの種類に関しては，未解明のままであった．本年度の解析により，α毒素は，細胞膜上のGM1aに結合後，毒素自身が保有するホスホリパーゼC活性により細胞膜リン脂質組成を変化させることにより，GM1aに隣接するTrkAのリン酸化を惹起していること，さらに，TrkAのアダプタータンパク質として存在している内因性ホスホリパーゼCγ-1が特異的に活性化していることを見出した．
約四半世紀の間明らかにされていなかったα毒素の受容体の発見、及び毒素によって活性化される内因性ホスホリパーゼCの種類を同定できていることから，本申請課題は，順調に遂行していると考える．

Strategy for Future Research Activity

研究計画は，ほぼすべて順調に遂行し，完了目前であるが，「α毒素とシアル酸，及びGM1aの糖鎖部位との複合体結晶構造解析」に関しては，未だ結晶すら得られていない状況である．次年度は，ボツリヌス神経毒素と糖との複合体解析を参考にして解析する予定である．
次年度は，本年度得られた研究結果をまとめ、原著論文、及び総説を投稿する予定である．

Research Products

• [Journal Article] Phospholipase C produced by Clostridium botulinum types C and D: comparison of gene, enzymatic, and biological activities with those of Clostridium perfringens alpha-toxin. (2013)
  • Author(s): Fatmawati, N.N.D., Sakaguchi, Y., Suzuki, T., Oda, M., Shimizu, K., Yamamoto, Y., Sakurai, J., Matsushita, O., Oguma, K
  • Journal Title: Acta Med. Okayama Volume: 67 Pages: 9-18
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of Vizantin, a safe immunostimulant, based on the structure-activity relationship of Treharose-6,6'-Dicorynomycolate. (2013)
  • Author(s): Yamamoto, H., Oda, M., Nakano, M., Watanabe, N., Yabiku, K., Shibutani, M., Inoue, M., Imagawa, H., Nagahama, M., Himeno, S., Setsu, K., Sakurai, J., Nishizawa, M.
  • Journal Title: J. Med. Chem. Volume: 56 Pages: 381-385
  • DOI: 10.1021/jm3016443.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bacillus cereus sphingomyelinase recognizes ganglioside GM3. (2013)
  • Author(s): Oda, M., Fujita, A., Okui, K., Miyamoto, K., Shibutani, M., Takagishi, T., Kobayashi, K., Nagahama, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 431 Pages: 164-168
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Arginine ADP-ribosylation Mechanism Based on Structural Snapshots of Iota-toxin and Actin Complex. (2013)
  • Author(s): Tsurumura, T., Tsumori, Y., Qiu, H., Oda, M., Sakurai, J., Nagahama, M., Tsuge, H.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. Volume: 110 Pages: 4267-4272
  • DOI: 10.1073/pnas.1217227110.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Concise Synthesis of a Probe Molecule Enabling Analysis and Imaging of Vizantin. (2013)
  • Author(s): Yamamoto, H., Oda, M., Nakano, M., Watanabe, N., Yabiku, K., Shibutani, M., Nakanishi, T., Suenaga, M., Inoue, M., Imagawa, H., Nagahama, M., Matsunaga, Y., Himeno, S., Setsu, K., Sakurai, J., Nishizawa, M.
  • Journal Title: Chem. Pharm. Bull. Volume: 61 Pages: 452-459
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A recombinant carboxy-terminal domain of alpha-toxin protects mice against Clostridium perfringens. (2013)
  • Author(s): Nagahama, M., Oda, M., Kobayashi, K., Ochi, S., Takagishi, T., Shibutani, M., Sakurai, J.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 57 Pages: 340-345
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12036.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Computational module assembled from different protease family motifs identifiesPI PLC from Bacillus cereus as a putative prolyl peptidase having a serine protease scaffold. (2013)
  • Author(s): Ramirez, A.R., Shukla, M., Oda, M., Chakraborty, S., Minda, R., Asgeirsson, B., Goni, FM., Rao, BJ.
  • Journal Title: PLoS one Volume: 8 Pages: e70923
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0070923
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The p38 MAPK and JNK pathways protect host cells against Clostridium perfringens beta-toxin. (2013)
  • Author(s): Nagahama, M., Shibutani, M., Seike, S., Yonezaki, M., Takagishi, T., Oda, M., Kobayashi, K., Sakurai, J.
  • Journal Title: Infect. Immun. Volume: 81 Pages: 3703-3708
  • DOI: 10.1128/IAI.00579-13
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dipeptidyl peptidase-IV inhibitors used in type-2 diabetes inhibit a phospholipase C: a case of promiscuous scaffolds in proteins. (2013)
  • Author(s): Chakraborty, S., Rendon-Ramirez, A., Asgeirsson, B., Dutta, M., Ghosh, A., Oda, M., Venkatramani, R., Rao, B., Dandekar, A., Goni, F.
  • Journal Title: F1000Research Volume: 2 Pages: 286
  • DOI: 10.12688/f1000research.2-286.v1
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 研究のツキと運を呼び込むために (2014)
  • Author(s): 小田真隆
  • Organizer: 第87回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 東京都、船堀タワーホール
  • Year and Date: 20140326-20140328
  • Invited
• [Presentation] ウエルシュ菌ε毒素のオリゴマー形成における中性スフィンゴミエリナーゼの関与 (2014)
  • Author(s): 高岸照久、小田真隆、永浜政博
  • Organizer: 第87回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 東京都、船堀タワーホール
  • Year and Date: 20140326-20140328
• [Presentation] ウエルシュ菌α毒素の病原性発現 におけるGM1a/TrkA複合体の役割 (2013)
  • Author(s): 小田真隆
  • Organizer: 第66 回日本細菌学会中国・四国支部総会
  • Place of Presentation: 広島県、広島国際大学
  • Year and Date: 20131012-20131013
  • Invited
• [Presentation] 敗血症患者由来セレウス菌の病原性発現とスフィンゴミエリナーゼの関係 (2013)
  • Author(s): 小田真隆、櫻井純、永浜政博
  • Organizer: トキシンシンポジウム
  • Place of Presentation: 兵庫県、楓香荘
  • Year and Date: 20130717-20130719
  • Invited
• [Remarks] 新潟大学 大学院医歯学総合研究科 微生物感染症学分野
  • URL: http://www.dent.niigata-u.ac.jp/microbio/microbio.html