2014 Fiscal Year Annual Research Report
赤血球膜Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの簡易活性測定法開発と臨床検査への応用
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24590702
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| Research Institution | Chiba Institute of Science |
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Principal Investigator |
三村 邦裕 千葉科学大学, 危機管理学部, 教授 (40439039)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 聡 千葉科学大学, 危機管理学部, 講師 (30406805)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 赤血球膜タンパク / Na+/K+-ATPase / ナトリウムポンプ / HPLC / C12E8 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の最終目的は赤血球からのNa＋/K＋-ATPaseを単離する方法を開発することで糖尿病を始め、骨粗鬆症、関節リウマチなどの生活習慣病の予防や診断に貢献できる新たな臨床検査法を確立することである。本年度は赤血球膜蛋白の中からより純度の高いNa＋/K＋-ATPaseを得るためにWGA-Agaroseゲルを用いて夾雑物の分離を試みた。その結果、阻害糖である0.03M GlcNACで溶出したピークを目的物質として捉えることができた。またSDS-PAGEを用いたNa+/K+-ATPaseサブユニット構造の解析を行ったが泳動後のCBB染色では検出感度の問題でバンドが認められなかったため鍍銀染色を試み、標準物質であるNa+/K+-ATPaseα1に認められ、FTに認められないバンドの検出を行った。その結果、スタンダード分子量97,000付近にBF1、BF2、BF3に抽出された蛋白質に目的とするバンドが確認できた。さらに我々がブタ腎尿細管上皮より分離精製したNa＋/K＋-ATPaseと比較検討して赤血球膜から得られた標品が目的物質かを検証した。C12E8－SECを行ったところ、Na＋/K＋-ATPase の3つのピークが確認でき、これらはブタ腎から得られたピーク位置と一致していた。さらにNa＋/K＋-ATPaseサブユニット構造(α、β、γ）の検出と定量のために採取したT分画、D分画、P分画を濃縮し、1.0％SDS pH7.0の溶出液を用いてHPLCを用いて分離を試みた結果、3つの溶出位置の異なるピークが認められ、これもブタ腎から得られたNa＋/K＋-ATPaseのα、β、γの溶出位置と一致していた。その結果、我々が開発した赤血球から簡易的に単離する方法は、目的物質を的確に捉えていることが確認できた。
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