2012 Fiscal Year Research-status Report
多機能メカノセンサーＴＲＰＶ２の成体知覚神経細胞における機能と疼痛への関与の精査
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24590725
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
片野坂 公明 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教 (50335006)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | TRPV2 / 機械受容 / 疼痛 / 一次知覚神経 / 侵害受容器 |
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| Research Abstract |
本研究では、成体末梢神経系における非特異的陽イオンチャネルTRPV2の機能について、独自に作成した知覚神経特異的遺伝子欠損マウスを用いて解析する。
今年度は、Cre-loxPシステムを利用した知覚神経特異的TRPV2欠損マウスを樹立し、各種行動試験により本系統での痛覚異常の有無を調べた（H24計画の実験1）。樹立したTRPV2欠損系統（TRPV2 flox/flox; Cre+） について、脊髄後根神経節(DRG)でのTRPV2発現がみられないことを確認した。TRPV2欠損個体の腓腹神経には、数や形態の上で正常個体 (TRPV2 flox/flox; Cre－の同腹仔)と同様の軸索が観察され、正常な知覚神経線維の発達が確認された。このTRPV2欠損マウスの熱痛覚行動は正常個体と同様であったが、機械刺激に対する逃避行動が減弱していた。この結果から、TRPV2の成体末梢神経系での役割として､機械痛覚への関与が示唆された。
また、TRPV2の機能を細胞レベルで検討するため、培養DRG細胞の機械応答を調べた。野生型マウスのDRG細胞を単離してシリコン薄膜上で培養し、シリコン膜の伸展により生じる細胞応答をFura2イメージングにより測定した。その結果、野生型の細胞において、械刺激後の細胞内カルシウムレベルの回復が速いタイプと遅いタイプの細胞が観察された。今後、TRPV2欠損マウスの細胞を用いて、機械応答とTRPV2との関連を調べる予定である（H25計画の実験3の一部を前倒しで実施）。
さらに、侵害受容器の活動に伴うDRGでのERKのリン酸化（pERK）を指標として、強い機械刺激に応答する細胞を免疫組織化学的に同定した。強い機械刺激への感受性を持つpERK陽性細胞の約36％がTRPV2陽性であり、TRPV2と侵害的機械受容器との関連性が示唆された（ H24計画の実験3を一部変更）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究計画のうち、これまでに、「知覚神経特異的遺伝子欠損マウスの系統の樹立」、および本系統のマウスを用いた「痛覚行動試験」については、予定通りに終了しており、TRPV2の新たな役割を示唆する結果が得られている。その他、本系統のマウスにおいて、組織形態学的に末梢神経の発達に異常がないことを確認するなど、結果の信頼性を高めるための計画外の実験も実施した。加えて、脊髄後根神経節細胞の機械応答を調べる実験を前倒しで実施し、野生型知覚神経細胞の伸展刺激に対する応答のタイプの分類に成功した。現在は、同じ細胞実験系を用いて、遺伝子欠損マウス由来の脊髄神経節細胞の機械応答との比較を行っている。この細胞実験は、今後の研究成果発表を鑑みて、より関連性の高い実験を先に進める必要があると考え、当初平成25年度に予定していた実験を他に先行して実施した。また、同様の観点から、高温感受性の脊髄神経節細胞の細胞タイプを解析する実験（昨年度実験計画の実験２）に関しても、実験対象を変更し、機械感受性細胞の細胞タイプの特定を優先的に実施することとした。
このように、実験の実施順序を年度間で変更したため、研究開始当初は平成24年度に実施予定であった、「触圧覚と固有感覚を調べるための行動実験の構築と予備検討（昨年度実験計画の実験１後半）」、および「神経座滅損傷によるTRPV2の発現変動の検討（昨年度実験計画の実験３）」については全く実施できていない。
以上のように、平成24年度に実施予定であった計画に関しては遅れが生じているものの、平成25年度に実施予定の実験を既に進めており、研究計画全体の進度としては概ね順調であると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度は、まず現在進行中である、正常マウスと遺伝子欠損マウス由来の脊髄神経節細胞の機械応答の比較を引き続き実施し、細胞レベルの機械応答へのTRPV2の関与を明らかにする。また、今年度、実験の順序の変更により実施しなかった、「触圧覚と固有感覚を調べるための行動実験の構築（H24年度実験計画，実験１後半）」、および「神経座滅損傷によるTRPV2の発現変動の検討（H24 年度実験計画，実験３）」は平成25年度より実施する。後者の実験については、顕著な発現変動が観察され、神経損傷や軸索再生へのTRPV２の関与が強く示唆される場合には、さらに実験を進め、神経損傷後の痛覚過敏の成立過程や、軸索再生の時間経過とTRPV2発現の関連性を詳細に調べ、TRPV2欠損によるこれらの過程への影響を解析する。しかし、明瞭な発現レベルの変動が見られない場合には、時間的な制約から本実験は中断し、他の実験計画を優先して実施する。残りの実験計画については、交付申請時の計画通りに実施する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度（平成24年度）は、今後の研究成果発表の観点から、より関連性の高い実験を先に進める必要があり、当初予定していた研究計画から、実施する実験の順序を変更した。そのため、平成25年度に計画していた比較的少額の消耗品費のみで実施可能な実験を前倒しして行なうこととなり、当初予定よりも物品費としての支出が少なくなった。また、昨年度は、所属部局内の人員の異動と研究機器の移動により、本研究で使用予定であった実験機器の継続使用ができなくなったため、平成25年度に代替機器類の購入が必要となることを考慮して、次年度使用額として持ち越した。この経費は次年度（平成25年度）の物品費として、代替機器等の購入に使用する計画である。旅費およびその他の経費については、ほぼ交付申請時通りの使用を予定している。
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