2014 Fiscal Year Annual Research Report
次世代薬毒物スクリーニング法の開発を目指した抗体ファージライブラリーの構築と応用
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24590859
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 助教 (80284751)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 薬毒物スクリーニング / 法医中毒学 / 組換え抗体 / 一本鎖抗体 / フルボキサミン / 向精神薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は抗体ファージライブラリー法などの遺伝子工学的技術によって抗薬物抗体を迅速に検索・調製し、それによる薬毒物の免疫学的スクリーニング法を構築する事を目的とするものである。平成26年度は、Q-body技術を利用して抗原である抗うつ薬フルボキサミン（FLV）との反応性を調べた。また、調製した組換え抗体のFLVやその他薬物に対する反応性について調べた。
まず、構築済みであったFLVに対するQ-body発現ベクターを用いて大腸菌の形質転換を行った。これを常法に従って培養、発現誘導を行って目的タンパクの産生を確認し、回収・精製を行った。さらに、得たタンパクに対して蛍光標識を行ってQ-bodyを調製した。調製したQ-bodyはFLV（10 uM）添加によって蛍光強度の上昇が確認された。
次に、調製したFLVに対する一本鎖抗体（scFv）について、そのFLV結合能を表面プラズモン共鳴解析によって確認した。scFv発現ベクターは、抗体可変領域（VL、VH）の各遺伝子をN末端からVLVHの順で繋いだものをLH型、VHVLの順で繋いだものをHL型として2種構築した。各ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、常法に従って培養、発現誘導の後に目的タンパクの回収・精製を行った。得たタンパクのFLVに対する解離定数は、LH型で7.6×10-9 M、HL型で3.8×10-9 Mであり一般的なモノクローナル抗体と同等の結合能を示した。
さらに、その他の薬物との交差反応性についてELISA法による非競合試験で確認を行った。その結果、クロルプロマジンでは100 uMから、イミプラミン、プロメタジンでは1 mMで反応が認められた。これは元来のモノクローナル抗体の性質を継承しており、組換え抗体への構造変化が抗原特異性に影響していない事を示唆する結果であった。
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[Presentation] Application of antibody engineering to drug screening: Preparation of the anti-fluvoxamine Quenchbody, a novel fluorescent biosensor2014
Author(s)
Sasao A, Takaki M, Jeong HJ, Ohtsu Y, Mishima S, Yonemitsu K, Morioka H, Ueda H, Nishitani Y
Organizer
9th International Symposium on Advances in Legal Medicine and 98th Congress of the Japanese Society of Legal Medicine
Place of Presentation
Fukuoka, Japan
Year and Date
2014-06-16 – 2016-06-20
