2012 Fiscal Year Research-status Report
骨髄由来ＥＰＣの深部静脈血栓塞栓症への関与の解明と新しい血栓陳旧度判定法の確立
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24590863
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
野坂 みずほ 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00244731)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 裕子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (10364077)
木村 章彦 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (60136611)
近藤 稔和 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70251923)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 深部静脈血栓塞栓症 / IFN-gamma / TNF-alpha / TNF-Rp55 / 血管新生 / EPC |
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| Research Abstract |
マウスを用いて下大静脈結紮による深部静脈血栓症（DVT）モデルを作成して，その血栓における血液凝固線溶系因子，血栓溶解に関わっていると考えられるサイトカイン，さらに骨髄由来線維細胞（fibrocyte），血管内皮前駆細胞（EPC）の，血栓陳旧度にともなう動態を検討している．
野生型マウスに比較してTNF-Rp55ノックアウトマウスでは，血栓の溶解が遅延することが明らかとなり，TNF-alpha-TNF-Rp55 axisが血栓溶解の促進因子であることを見出した．血栓形成から溶解に至る過程における血栓内のIFN-gamma，TNF-alpha，TNF-R1の動態は，剖検例においても血栓の陳旧度判定に有用な指標となり得ると考えられ，さらに，これらのサイトカインの動態を把握することが血栓症の予防や治療方法の開発に有用であると考えられた．
またGFP骨髄キメラマウスを用いて深部静脈血栓塞栓症モデルを作成したところ，その下大静脈の凍結切片の血栓内に多数のGFP陽性細胞が観察できた．これは骨髄細胞が骨髄から遊走してきたことの証明になった．
さらに，血栓陳旧度にともなう野生型マウスの血栓パラフィン包埋切片について，CD45とcollagen type 1の蛍光二重染色によりfibrocyteの動態を，またCD34とFlk-2の蛍光二重染色によりEPCの動態を解析した．その結果，fibrocyteは血栓陳旧度にともなって変化し，下大静脈結紮後14日後に最も増加することが分かった．EPCについては，作成したGFP骨髄キメラマウスを用いてさらなる検討を行っているが，血栓の予防・治療方法の開発に重要な結果を得られると考えている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型マウスおよび遺伝子改変マウスを用いてDVTモデルを作成し，その下大静脈のパラフィン包埋切片のヘマトキシリン・エオジン染色，マッソン・トリクローム染色を行った．さらに白血球（好中球，マクロファージ）やサイトカイン，ケモカイン，fibrocyte，EPCについての免疫組織化学的染色または蛍光二重染色を，用手法ならびに，自動免疫染色装置にて行っている．血栓におけるサイトカイン，細胞外基質分解酵素群（MMP），血液凝固線溶系因子の遺伝子発現を，リアルタイムRT-PCRによって定量的に評価し，血栓陳旧度にともなう分子生物学的変化に関する結果を集積しているところである．特に血栓陳旧度判定においては，IFN-gamma，TNF-alpha，TNF-Rp55の免疫組織化学的染色結果より，血栓陳旧度の基準となり得る新たな指標を見出し，研究成果を発表を予定している．
血栓形成過程におけるEPCの動態解析を行うために，GFP骨髄キメラマウスを用いて深部静脈血栓塞栓症モデルを作成している．GFP骨髄キメラマウスは，GFPトランスジェニックマウス（ドナーマウス）から骨髄細胞を無菌的に採取して，12Gyの放射線を照射された8～12週齢のC57BL/6マウス（レシピエント）に骨髄細胞を静脈投与して作成している．そしてマウスの下大静脈を3-0絹縫合糸により結紮することにより，血栓を惹起する．結紮後一定期間生存後に安楽死させ，血栓を含む下大静脈部を採取または，下大静脈内から血栓のみを採取し，これらについて凍結切片，パラフィン包埋切片，または血栓重量等の測定の後，遺伝子発現の評価に用いている．本研究の目的を達成するために，必要な結果を着実に得ており，最終年度終了までに目的を達成できると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
高齢者の増加や，食生活の変化をはじめ，DVTを惹起する要因は今後も増え続けることが予想され，したがって，本研究の結果はDVTの予防・治療方法の確立に重要な示唆を与えると考えられる．そこで次の点に重点を置いて研究を推進する．
骨髄由来細胞の血栓部位への遊走を確認するために，下大静脈を結紮したGFP骨髄キメラマウスから採取した下大静脈組織の凍結切片を作成して，蛍光顕微鏡を用いて血栓およびその周辺部におけるGFP陽性細胞およびマクロファージやケモカインレセプターとの蛍光二重染色を行い，これらの細胞の血栓陳旧度にともなう動態を明らかにする．
経時的に採取した下大静脈組織を細切して，組織中の細胞を単離する．これら単離した細胞に，EPCの細胞表面抗原に対する異なる２組の抗体を組み合わせ（抗CD34抗体と抗Flk-1抗体，または抗c-kit抗体と抗Tie-2抗体）を反応させた後，フローサイトメーターによりEPCを検出し，血栓形成・溶解過程におけるEPCの経時的動態を検索し，各抗体の組み合わせによるEPCの動態を比較検討する．
経時的に採取した下大静脈組織のパラフィン切片を作製する．各切片について，（抗CD34抗体と抗Flk-1抗体の組み合わせと抗c-kit抗体と抗Tie-2抗体組み合わせによる二重免疫蛍光染色を行い，EPCを組織レベルで検出する．これまでに得られた結果と総合的に判断して，どちらの抗体組み合わせがEPC検出のためにより適切かを検討する．さらに，いずれか適した抗体の組み合わせを決定後，EPCにおけるケモカインレセプターの発現解析の結果，最も強く発現しているケモカインレセプターに対する抗体を含めた三重免疫蛍光染色を行い，より特異的にEPCの検出を試みる．
以上，基礎的研究結果に基づいて，血栓形成および溶解過程におけるEPCの動態を解明することにより法医実務的研究へと発展させる．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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