腫瘍壊死因子前駆体と産生酵素に介在する膜蛋白機能解析と新規抑制法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24590949
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 城 卓志 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30231369)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷田 諭史 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30528782)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 炎症性腸疾患 / TNF-α / ADAM17 / ARP36-2 / 新規治療ターゲット

Outline of Annual Research Achievements

TNFαは炎症性腸疾患の進展・増悪に重要な役割を果たしている炎症性サイトカインであり、その制御が炎症性腸疾患治療の中心となっている。細胞膜上の膜結合型TNFαは、ADAM17により可溶型TNFαに切断・遊離（shedding）されるADAM17は２型膜タンパク（細胞質内にN末端が存在する）TNF-αのほかにも、１型膜タンパク（細胞質内にC末端が存在する）のAmphiregulin、Heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF)、Transforming growth factor(TGF-α)など多様である。われわれは、ADAM17がもつ標的膜蛋白切断の多様性を解明するために、ADAM17に関連する介在タンパクが存在するのではないかと仮説をたて、ADAM17と相互作用するタンパクを網羅的に同定することで、TNFαsheddingのメカニズムを明らかにし、新規治療ターゲットを探索した。【方法】大腸上皮細胞株（HCT116）および単球細胞株（U937）を使用した。ADAM17によるTNFαsheddingに関連する介在タンパクを同定するため、抗Amphiregulin抗体で共免疫沈降後MALDI/TOFMSにて網羅的に同定した。AP-TNFα発現させ、TNFαshedding測定系を確立した。MALDI/TOFMSにて同定された候補蛋白をsiRNAで欠失させたあと、TNFαsheddingを測定した。【結果】MALDI/TOFMS解析にて、amphiregulin-regulating protein (ARP) 36-2に着目した。HCT116細胞およびU937細胞を刺激すると、培養液中のTNFα濃度が経時的に増加した。KB-R7785、siRNAによりADAM17を欠失すると、有意に抑制された。siRNAによりARP36-2を欠失しても、TNFαsheddingによる濃度上昇が、有意に抑制された。ARP36-2は，1型膜タンパクのAmphiregulinやHB-EGFのsheddingを抑制しなかった。【結語】ARP36-2は、TNFαsheddingを制御する炎症性腸疾患新規治療ターゲットになりうると思われた。