オーバル細胞増殖を介した肝再生・修復における核内受容体ＣＡＲの役割

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24590954
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 山崎 勇一 群馬大学, 医学部附属病院, 助教 (00582404)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柿崎 暁 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80344935)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 核内受容体CAR / オーバル細胞増殖 / 肝再生

Outline of Annual Research Achievements

1. CARおよびPXRノックアウトマウスを用いた解析
CARおよびPXRノックアウトマウスを用いて14、21日間のDDC添加食での解析を進めた。CARを活性化するためTCPOBOPを投与した野生マウスを加え、DDC添加食後マウス肝で病理組織標本を作製し、HE染色及び、EpCAM、CK19の免疫組織染色によりオーバル細胞増殖を再確認した。CARおよびPXRノックアウトマウスを用いて14、21日間の0.165%エチオニン添加水コリン欠乏（CDE）食での解析を進めた。CDE食後マウス肝で、病理組織標本を作製し、HE染色及び、EpCAM、CK19の免疫組織染色によりオーバル細胞増殖を再確認した。また、CDE食後のマウス肝でCARにより調節される遺伝子およびオーバル細胞増殖に特異的な遺伝子発現をリアルタイムPCRを用いて再検討した
2. フローサイトメトリー法によるオーバル細胞の分離、同定
フローサイトメトリー法によりCARノックアウトマウス、野生マウスからオーバル細胞の分離、同定を行った。CARを活性化するためTCPOBOPを投与したCARノックアウトマウス、野生マウスからもオーバル細胞の分離、同定を行った。RNAを抽出し、CARにより調節されるCYP2Bl0、GADD45α などの遺伝子発現、オーバル細胞増殖に特異的なEpCAM、CK19などの遺伝子発現、肝再生に関連する遺伝子発現をリアルタイムPCRを用いて検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CARおよびPXRノックアウトマウスを用いた解析およびフローサイトメトリー法によるオーバル細胞の分離、同定ともにおおむね頂調に進展している

Strategy for Future Research Activity

1. CARおよびPXRノックアウトマウスを用いた解析
前々年度、前年度の解析をさらに推進、TCPOBOPやAndrostanoによるCARの活性化あるいは抑制が与える、CDE食による遺伝子発現および蛋白発現レベルの変化、局在への影響を検討する。
2. 初代培養オーバル細胞を用いたinvitroの実験系
フローサイトメトリー法によるオーバル細胞の分離、同定による初代培養オーバル細胞の実験系を用いて遺伝子発現解析、TCPOBOP、PBなどのCARactivator によるオーバル細胞増殖への影響を、CARにより調節されるCYP2Bl0、GADD45βなどのmRNAの測定やMTT、BrdU法などによる細胞増殖アッセイ、細胞遊走アッセイにより評価する。

Causes of Carryover

前年度までの未使用金と併せて試薬、抗体、特別食購入、出張費などに使用した結果、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度は試薬、抗体など追加購入した上で下記の検討を行う。
1 CARおよびPXRノックアウトマウスを用いた解析：CDE食による遺伝子発現および蛋自発現レベルの変化、局在への影響を再検討する。
2 初代培養オーバル細胞を用いたinvitroの実験系：フローサイトメトリー法によるオーバル細胞の分離、同定による初代培養オーバル細胞の実験系を用いて遺伝子発現解析やMTT、BrdU法などによる細胞増殖アッセイ、細胞遊走アッセイにより再評価する。