小型骨髄由来肝修復細胞の形態解析と特異因子の探求

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24590978
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 山本 直樹 山口大学, 大学教育機構, 講師 (90448283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺井 崇二 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00332809) ; 藤澤 浩一 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00448284) ; 高見 太郎 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60511251)
• Keywords: 再生医療 / 幹細胞 / 免疫電顕 / 骨髄細胞 / AutoMACS / EpCAM

Research Abstract

FEI社製の透過型電子顕微鏡Tecnai12BTと走査型電子顕微鏡Qunta3D FEG Dual Beamシステムを用いて二種類の骨髄由来肝臓修復細胞である核N/C比の高い小型細胞(Liv2陽性・A-6陽性)と類円形の大型細胞(MMP9陽性)の形態学的変化の観察を継続しながら、GFP/CCl4モデルでの骨髄細胞投与後の肝組織内のEpCAM抗体陽性細胞,GFP抗体陽性細胞の割合をFACS解析で行った。またEpCAM陽性GFP陽性小型骨髄由来細胞をBeckmanCoulter MoFlo Astriosで分離し,細胞の形態の特徴・培養増殖や保存可能かどうかの解析を開始したが、Sortingの機器のトラブルやSorting後の細胞死が多く、試行錯誤を繰り返している。
今後は採取した細胞を利用してDNAアレイで網羅的に特異的な遺伝子発現の解析を行う。
また持続肝障害(CCl4)モデルから肝細胞,肝星細胞,Kupffur細胞,肝類洞内皮細胞,胆管細胞,Nk細胞等をp75NTRやEpCAM, F4/80等各細胞の特異抗体によってAutoMACSで分離して, 各細胞とGFP陽性骨髄細胞と二重構造の培養プレートで共培養して、骨髄細胞にどのような形態学的変化があるかを検証している。また高脂肪食モデルからの脂肪細胞と骨髄細胞との共培養を行い形態学的変化の観察を開始した。今後は電顕で骨髄細胞の構造や細胞内器官を比較する。また培養液を採取し,Bio-PlexTMサスペンションアレイシステムで様々なサイトカイン,growth factor,ケモカイン等の発現を調べる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

EpCAM陽性GFP陽性小型骨髄由来細胞のBeckmanCoulter MoFlo Astriosによる分離にはSortingの機器のトラブルやSorting後の細胞死が多く、試行錯誤を繰り返しているが、何とか細胞の形態の特徴・培養増殖や保存可能かどうかの解析を開始していることと、持続肝障害(CCl4)モデルから肝細胞,肝星細胞,Kupffur細胞,肝類洞内皮細胞,胆管細胞,Nk細胞等をp75NTRやEpCAM, F4/80等各細胞の特異抗体によってAutoMACSで分離して, 各細胞とGFP陽性骨髄細胞と二重構造の培養プレートでの共培養を開始している。

Strategy for Future Research Activity

EpCAM陽性GFP陽性小型骨髄由来細胞のBeckmanCoulter MoFlo Astriosによる分離にはSortingの機器のトラブルやSorting後の細胞死が多いため、試行錯誤を繰り返しているが、できるだけいい条件での解析を行える方法の確立を目指す。また細胞の形態の特徴・培養増殖や保存可能かどうかの解析を行う。また持続肝障害(CCl4)モデルから肝細胞,肝星細胞等様々な細胞を各細胞の特異抗体によってAutoMACSで分離し, 各細胞とGFP陽性骨髄細胞と二重構造の培養プレートでの共培養を繰り返し、骨髄細胞にどのような形態学的変化があるかを電顕等で検証していく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度にEpCAM陽性GFP陽性小型骨髄由来細胞のBeckmanCoulter MoFlo Astriosによる分離をしていたが、Sortingの機器のトラブルやSorting後の細胞死が多く、再度実験方法を考慮するため消耗品の購入を見送ったため未使用額が生じた。
EpCAM陽性GFP陽性小型骨髄由来細胞のBeckmanCoulter MoFlo Astriosによる分離のためのSortingの消耗品の購入費にあてる。

Research Products

• [Journal Article] Serum transferrin as a predictor of prognosis for hepatic arterial infusion chemotherapy in advanced hepatocellular carcinoma. (2014)
  • Author(s): Zaitsu J, Yamasaki T, Saeki I, Harima Y, Iwamoto T, Harima Y, Matsumoto T, Urata Y, Hidaka I, Marumoto Y, Ishikawa T, Takami T, Yamamoto N, Kaino S, Uchida K, Terai S, Sakaida I.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 44(5) Pages: 481-490
  • DOI: 10.1111/hepr.12141.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Improvement of liver fibrosis by infusion of cultured cells derived from human bone marrow. (2013)
  • Author(s): Tanimoto H, Terai S, Taro T, Murata Y, Fujisawa K, Yamamoto N, Sakaida I.
  • Journal Title: Cell Tissue Res. Volume: 354(3) Pages: 717-28
  • DOI: 10.1007/s00441-013-1727-2.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Canine mesenchymal stem cells show antioxidant properties against thioacetamide-induced liver injury in vitro and in vivo. (2013)
  • Author(s): Quintanilha LF, Takami T, Hirose Y, Fujisawa K, Murata Y, Yamamoto N, Goldenberg RC, Terai S, Sakaida I.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1111/hepr.12204
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bone-marrow-derived cells cultured in serum-free medium reduce liver fibrosis and improve liver function in carbon-tetrachloride-treated cirrhotic mice. (2013)
  • Author(s): Iwamoto T, Terai S, Hisanaga T, Takami T, Yamamoto N, Watanabe S, Sakaida I.
  • Journal Title: Cell Tissue Res. Volume: 351(3) Pages: 487-95
  • DOI: 10.1007/s00441-012-1528-z.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bortezomib induces tumor-specific cell death and growth inhibition in hepatocellular carcinoma and improves liver fibrosis. (2013)
  • Author(s): Saeki I, Terai S, Fujisawa K, Takami T, Yamamoto N, Matsumoto T, Hirose Y, Murata Y, Yamasaki T, Sakaida I.
  • Journal Title: J Gastroenterol. Volume: 48(6) Pages: 738-50
  • DOI: 10.1007/s00535-012-0675-z
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 自己骨髄細胞による肝臓再生療法の取り組み (2013)
  • Author(s): 高見 太郎
  • Organizer: 第40回日本肝臓学会西部会
  • Place of Presentation: 長良川国際会議場(岐阜)
  • Year and Date: 20131206-20131207
• [Presentation] The new oral iron chelator, Deferasirox, is the new drug to prevent Liver Fibrosis and Hepatocarcinogenesis (2013)
  • Author(s): Naoki Yamamoto
  • Organizer: AASLD's 64th Annual Liver Meeting 2013
  • Place of Presentation: Washington Convention Center(Washington USA)
  • Year and Date: 20131101-20131105
• [Presentation] Basic studies for a less invasive liver regeneration therapy for liver cirrhosis using cultured autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells with stabilization of redox homeostasis. (2013)
  • Author(s): Taro Takami
  • Organizer: AASLD's 64th Annual Liver Meeting 2013
  • Place of Presentation: Washington Convention Center(Washington USA)
  • Year and Date: 20131101-20131105
• [Presentation] The new oral iron chelator prevents liver fibrosis and preneoplastic lesions in liver cancer and liver cirrhosis model (2013)
  • Author(s): Naoki Yamamoto
  • Organizer: The 21st United European Gastroenterology Week (UEGW /Gastro 2013 )
  • Place of Presentation: ICC, Berlin (Germany)
  • Year and Date: 20131012-20131016
• [Presentation] Basic studies for a less invasive liver regeneration therapy for liver cirrhosis using cultured autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells with stabilization of redox homeostasis. (2013)
  • Author(s): Taro Takami
  • Organizer: The 20th Annual Meeting of the Japanese Society for the Research of Hepatic Cells (20th JSRH)
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場(大阪）
  • Year and Date: 20130926-20130927
• [Presentation] ヒト骨髄由来および脂肪組織由来間葉系幹細胞における組織因子およびIL-8の発現検討 (2013)
  • Author(s): 高見 太郎
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル(東京）
  • Year and Date: 20130606-20130607