複製活性を保持した精製複製複合体からＨＣＶ複製に関与する宿主因子の同定と解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591001
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 相崎 英樹 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (00333360)
• Keywords: C型肝炎ウイルス

Research Abstract

我々はこれまでに、C型肝炎ウイルスが細胞内のER膜をMembranus webと言う胞状の袋に変化さえ、この内部で複製を行っていることを見出してきた。複製はウイルスRNA合成と蛋白翻訳の２つのステップに分けられる。しかしながら、それらの調整機構はわかっていない。
そこで、複製に必須と考えられているNS5Aに注目し、HCV生活環に関与する宿主因子の同定のため、膜画分に含まれる蛋白のうちNS5A蛋白に結合する宿主因子を検索し、20種の新規宿主因子を同定した。同定された宿主蛋白についてsiRNAを用いてウイルスRNA合成と蛋白翻訳への関与を解析したところ、ELAVL1およびRCN1の蛋白が翻訳に、ATAD3A、ELAVL1TBL２、RCN1、FKBP８の蛋白がウイルスRNA合成に重要な役割を果たしていることを見出した。翻訳に関与する２種類の蛋白はいずれもウイルスRNA合成に影響を与えていた。
今後はそのメカニズムの詳細を明らかにし、宿主因子を標的とした創薬の可能性についても検討していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までに、pull-down法によりNS5A蛋白と特異的に共沈する膜蛋白質をプロテオーム解析した結果、20種の新規宿主因子を同定し、siRNAを用いてスクルーニングしたところ、ELAVL1およびRCN1の蛋白が翻訳に、ATAD3A、ELAVL1、TBL２、RCN1、FKBP８の蛋白がウイルスRNA合成に重要な役割を果たしていることを見出した。さらに、スクリーニングで絞られた候補蛋白について、感染細胞、レプリコン細胞等、細胞培養系を用いて、shRNAや野生型/dominant negative体の発現プラスミドでウイルス産生への関与が確認できた。候補蛋白の複製、翻訳における影響をin vivoで確認できたので、ほぼ２年目の目標は達成した。

Strategy for Future Research Activity

（１）これまでに、候補蛋白の感染細胞、レプリコン細胞内における複製および翻訳に与える影響についてのin vivo解析が終了した。最終年度の本年度は、試験管内翻訳系、cell-free replication assayを行い、in vitroでの解析を行い、その複製および翻訳のスイッチングにおける役割を解析する。
（２）HCV複製複合体と同定した宿主蛋白の細胞内局在の免疫組織学的な観察;レプリコン細胞内で複製しているHCVゲノムをアクティブな状態で観察するため、Actinomycin D処理して細胞内のDNA dependent RNA polymeraseを抑えた上で、bromouridine triphosphat e (BrUTP)を細胞に導入し、免疫組織染色で観察する。BrUTPが取り込まれた新規に合成されたHCVRNAと宿主因子の細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察する。
（３）宿主因子とHCV非構造蛋白、HCV-RNAとの相互作用の解析; (2)の解析を通じて、HCV複製に関与していることが示された因子について、HCV非構造蛋白質(NS3, 4A, 4B, 5A, 5B)との相互作用をエピトーグタグ免疫沈降法、two-hybrid法、pull-down法などで解析する。各NS蛋白の免疫沈降法の条件検討も終わっている。HCV-RNAと宿主蛋白の結合について、UVクロスリンク法で解析する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

すでに実験系が確立しているin vivo実験でこれまでの結果を確認する作業を優先したため、昨年度は当初の予定より少ない使用額となった。本年度からin vitro実験を介している。
薬品類として2D-DIGE関連試薬、ウシ胎児血清、DMEM、TaqMan-PCR試薬、ELISA関連試薬、蛋白精製関連試薬等を購入する。プラスチッ ク器具類として、細胞培養容器、ピペット類、手袋等を購入予定である。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation and Identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP (2014)
  • Author(s): Iwamoto M, Watashi K, Tsukuda S, Aly1 HH, Fukasawa M, Suzuki R, Aizaki H, Ito T, Koiwai O, Kusuhara H, Wakita T
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 443 Pages: 808-813
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] J Gen Virol. (2014)
  • Author(s): Suzuki R, Ishikawa T, Konishi E, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Takasaki T, Wakita T
  • Journal Title: Production of single-round infectious chimeric flaviviruses with DNA-based Japanese encephalitis virus replicon. Volume: 95 Pages: 60-65
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HCV NS3 protease enhances liver fibrosis via binding to and activating TGF-β type I receptor (2013)
  • Author(s): Sakata K, Hara M, Terada T, Watanabe N, Takaya D, Yaguchi S, Matsumoto T, Matsuura T, Shirouzu M, Yokoyama S, Yamaguchi T, Miyazawa K, Aizaki H, Suzuki T, Wakita T, Imoto M, Kojima S
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 22 Pages: 7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biochem Biophys Res Commun. (2013)
  • Author(s): Nakajima S, Watashi K, Kamisuki S, Tsukuda S, Takemoto K, Matsuda M, Suzuki R, Aizaki H, Sugawara F, Wakita T
  • Journal Title: Specific inhibition of hepatitis C virus entry into host hepatocytes by fungi-derived sulochrin and its derivatives. Volume: 440 Pages: 515-520
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] J Biol Chem. (2013)
  • Author(s): Watashi K, Liang G, Iwamoto M, Marusawa H, Uchida N, Daito T, Kitamura K, Muramatsu M, Ohashi H, Kiyohara T, Suzuki R, Li J, Tong S, Tanaka Y, Murata K, Aizaki H, Wakita T.
  • Journal Title: Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor-α Trigger Restriction of Hepatitis B Virus Infection via a Cytidine Deaminase Activation-induced Cytidine Deaminase (AID). Volume: 288 Pages: 31715-31727
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Signal peptidase complex subunit 1 participates in the assembly of hepatitis C virus through an interaction with E2 and NS2. (2013)
  • Author(s): Suzuki R, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Matsuura Y, Wakita T, Suzuki T.
  • Journal Title: PLoS Pathog. Volume: 9 Pages: e1003589
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antiviral activity of glycyrrhizin against hepatitis C virus in vitro. (2013)
  • Author(s): Matsumoto Y, Matsuura T, Aoyagi H, Matsuda M, Hmwe SS, Date T, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Ichinose S, Wake K, Suzuki T, Miyamura T, Wakita T, Aizaki H.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 18 Pages: e68992.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutralizing antibodies induced by cell culture-derived hepatitis C virus protect against infection in mice. (2013)
  • Author(s): Akazawa D, Moriyama M, Yokokawa H, Omi N, Watanabe N, Date T, Morikawa K, Aizaki H, Ishii K, Kato T, Mochizuki H, Nakamura N, Wakita T.
  • Journal Title: Gastroenterology. Volume: 145 Pages: 447-455
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Regulation of Hepatitis C virus (HCV) release by phospholipase A2 and autophagy -Antiviral Activity of Glycyrrhizin against HCV (2013)
  • Author(s): Aoyagi H, Aizaki H, Matsumoto Y, Matsuda M, Hmwe SS, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Ichinose S, Matsuura T, Suzuki T, Wake K, Miyamura T, Wakita T.
  • Organizer: 日本 分子生物学会第36回年会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] プラスミドトランスフェクションに よるトランスパッケージング型1回感染性フラ ビウイルス産生系の確立. (2013)
  • Author(s): 鈴木亮介、石川知弘、小西英二、嵯峨涼平、 松田麻未、渡士幸一、相崎英樹、高崎智彦、脇 田隆字
  • Organizer: 日本分子生物学会 第36回年会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 当院で経験した、HIV陽性者に おける急性C型肝炎の集団発生について (2013)
  • Author(s): 井戸田一朗、加藤康幸、青柳東代、相崎英 樹、脇田隆字
  • Organizer: 第27 回日本エイズ学会
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 20131120-20131122
• [Presentation] 細胞内発現抗体 (イントラボディ)によるC型肝炎ウイルスの 増殖抑制. (2013)
  • Author(s): 松田麻未、斎藤憲司、鈴木亮介、佐藤充、 鐘ヶ江裕美、渡士幸一、相崎英樹、千葉丈、斎 藤泉、脇田隆字、鈴木哲朗.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] Phospholipase A2およびAutophagyによるC型肝 炎ウイルス(HCV)分泌過程の制御 ― グリチルリ チンによる抗HCV作用― (2013)
  • Author(s): 青柳東代, 相崎英樹, 藤本陽, 松本喜弘, 松田麻未, Su Su Hmwe,渡邉則幸, 渡士幸一, 鈴木亮介, 市野瀬志津子, 松浦知和, 鈴木哲 朗, 和氣健二郎, 宮村達男, 脇田隆字.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第 61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] C型肝炎ウイルス感染による宿主細胞の 脂質代謝変化とHepatic Lipase発現制御 (2013)
  • Author(s): 藤本陽, 相崎英樹, 松田麻未, 渡邉則幸, 渡士幸一, 鈴木亮介, 鈴木哲朗, 宮村達男, 脇 田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] C型肝炎ウイルス分泌過程はphospholipase Dが 関わる膜輸送により制御される (2013)
  • Author(s): 内田奈々子、渡士幸一、中嶋 翔、岩本将 士、鈴木亮介、相崎英樹、千葉 丈、脇田隆字
  • Organizer: 日本ウイルス 学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] B型肝炎 ウイルス侵入阻害剤の同定およびそのNTCPを介 した感染阻害機構の解明 (2013)
  • Author(s): 九十田千子、渡士幸一、岩本将士、鈴木亮 介、相崎英樹、小嶋聡一、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] ヒトNTCP安定発 現細胞株におけるB型肝炎ウイルス侵入機構の 解析 (2013)
  • Author(s): 岩本将士、渡士幸一、九十田千子、 Hussein Hassan Aly、鈴木亮介、相崎英樹、小 祝 修、楠原洋之、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] エンベロープペプチドを用いたHCV感染に重 要なアミノ酸領域の探索 (2013)
  • Author(s): 渡邉則幸, 伊達朋子、相崎英樹、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] C型肝炎 ウイルスNS5A結合タンパク質ELAVL1のウイルス 複製・翻訳スイッチング機構の解析 (2013)
  • Author(s): 後藤耕司、相崎英樹、渡邉則幸、渡士幸一、 鈴木亮介、山越智、四柳宏、森屋恭爾、小池和 彦、鈴木哲朗、宮村達男、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] IL-1/TNFaによるシチジンデ アミナーゼAID誘導を介したB型肝炎ウイルス感 染排除機構 (2013)
  • Author(s): 渡士幸一、Guoxin Liang、岩本将士、丸澤 宏之、喜多村晃一、村松正道、鈴木亮介、相崎 英樹、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] Liver X Receptor 転写 活性および感染性C型肝炎ウイルス粒 子産生を阻害する天然有機化合物の同 定 (2013)
  • Author(s): 中嶋翔、渡士幸一、紙透伸治、竹本 健二、鈴木亮介、相崎英樹、菅原二三 男、脇田隆字
  • Organizer: 日本 ウイルス学会第61回学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131110-20131112
• [Presentation] Analysis of bioactivity of fungal-derived natural products based on a virus infection system (2013)
  • Author(s): Nakajima S, Watashi K, Kamisuki S, TakemotoK,SuzukiR,AizakiH,SugawaraF,Wakita T
  • Organizer: The 2nd International Symposium on Chemical Biology of Natural Products: Target ID and Regulation of Bioactivity
  • Place of Presentation: Yokohama
  • Year and Date: 20131028-20131029
• [Presentation] Mechanistic analysis on hepatitis B virus entry in an NTCP-overexpressing cell line. (2013)
  • Author(s): Iwamoto M, Watashi K, Tsukuda S, Aly HH, Suzuki R, Aizaki H, Koiwai H, Kusuhara H, Wakita T
  • Organizer: 2013 International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses.
  • Place of Presentation: Shanghai, China.
  • Year and Date: 20131020-20131023
• [Presentation] A Retinoid Derivative Inhibits Hepatitis B Virus Entry Mediated by NTCP. (2013)
  • Author(s): Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Wakita T.
  • Organizer: International Meeting on Molecular Biology of Hepatitis B Viruses.
  • Place of Presentation: Shanghai, China.
  • Year and Date: 20131020-20131023
• [Presentation] Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase AID. (2013)
  • Author(s): Watashi K, Liang G, Iwamoto M, Marusawa H, Kitamura K, Muramatsu M, Suzuki R, Li J, Tong S, Tanaka Y, Murata K, Aizaki H, Wakita T.
  • Organizer: 2013 International Meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses
  • Place of Presentation: Shanghai, China.
  • Year and Date: 20131020-20131023
• [Presentation] Dynamic metabolomics change in HCV-infected cells, (2013)
  • Author(s): Aizaki H
  • Organizer: The 2013 Italy- Japan Liver Workshop“Hepatitis, Steatosis and Hepatocellular Carcinoma: molecular basis and clinical links”
  • Place of Presentation: Italy
  • Year and Date: 20131020-20131021
• [Presentation] Dynamics of the cellular metabolome during hepatitis C virus infection: Regulation of the lipoprotein metabolisms by hepatic lipase. (2013)
  • Author(s): Fujimoto A, Aizaki H, Matsuda M, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Suzuki T, Miyamura T, Wakita T
  • Organizer: 20th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Melbourne, Australia
  • Year and Date: 20131006-20131010
• [Presentation] Identification of a natural product inhibiting the transcriptional activity of liver X receptor and reducing the production of infectious HCV (2013)
  • Author(s): Nakajima S, Watashi K, Kamisuki S, TakemotoK,SuzukiR,AizakiH,SugawaraF, Wakita T
  • Organizer: 20th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Melbourne, Australia
  • Year and Date: 20131006-20131010
• [Presentation] HCV NS3 protease plus TNF-α promotes liver fibrosis via stimulating expression and activation of TGF-β type I receptor (2013)
  • Author(s): Sakata K, Hara M, Terada T, Watanabe N, Yaguchi S, Matsumoto M, Shirouzu M, Yokoyama S, Miyazawa K, Aizaki H, Suzuki T, Wakita T,Kojima S
  • Organizer: 第20回肝細胞研究会
  • Place of Presentation: Osaka
  • Year and Date: 20130926-20130927
• [Presentation] Hepatitis C virus RNA replication in human stellate cells regulates gene expression of extracellular matrix-related molecules (2013)
  • Author(s): Aizaki H, Watanabe N, Aoyagi H, Hmwe SS, Watashi K, Suzuki R, Kojima S, Matsuura T, Wake K, Miyamura T, Suzuki T, Wakita T
  • Organizer: International Symposium on Cells of the Hepatic Sinusoid
  • Place of Presentation: Osaka
  • Year and Date: 20130923-20130925
• [Presentation] Comprehensive and comparative proteomics reveals alterations of metabolomics between monolayer and three- dimensional cell cultures. (2013)
  • Author(s): agamori S, Aizaki H, Matsumoto Y, Isozumi N, Wiriyasermkul P, Matsuura T, Kanai Y
  • Organizer: 12th Human Proteome Organization World Congress 2013.
  • Place of Presentation: Yokohama
  • Year and Date: 20130914-20130918
• [Presentation] Antiviral activity of glycyrrhizin against hepatitis C virus in vitro (2013)
  • Author(s): Aoyagi H, Aizaki H, Matsumoto Y, Matsuda M, Hmwe SS, Watanabe N, Watashi K, SuzukiR,IchinoseS,MatsuuraT,SuzukiT, -79- Wake K, Miyamura T, Wakita T.
  • Organizer: The 12th Awaji international forum on infection and immunity
  • Place of Presentation: Awaji
  • Year and Date: 20130910-20130913
• [Presentation] Production of single-round infectious chimeric flaviviruses with a DNA-based Japanese encephalitis virus replicon. (2013)
  • Author(s): Suzuki R, Konishi E, Ishikawa T, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Takasaki T, WakitaT.
  • Organizer: Keystone Symposia, Positive Strand RNA Viruses
  • Place of Presentation: Boston, U.S.A.
  • Year and Date: 20130428-20130503
• [Book] 医学のあゆみ (2013)
  • Author(s): 相崎英樹
  • Total Pages: 2
  • Publisher: 医歯薬出版株式会社
• [Remarks] 国立感染症研究所ウイルス第二部
  • URL: URL:http://www.nih.go.jp/niid/ja/vir2-hv.html