2012 Fiscal Year Research-status Report
新規生理活性物質ＳＣＧＢ３Ａ２の肺線維症治療薬としての応用を目指した基盤研究
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24591151
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
黒谷 玲子 山形大学, 理工学研究科, 助教 (00453043)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 宏之 山形大学, 理工学研究科, 教授 (10375199)
柴田 陽光 山形大学, 医学部, 講師 (60333978)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | SCGB3A2 / 肺線維症 / アポトーシス / ブレオマイシン |
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| Research Abstract |
新規生理活性物質SCGB3A2は、肺炎や難治性の肺線維症の改善効果が示めされている。肺線維症は、細胞へのダメージ、炎症、コラーゲン沈着を経て重症化する。そこで、本研究では、SCGB3A2の肺線維症治療薬としての有効性を検証するために、進行した肺線維症に対するSCGB3A2の治療効果を解析した。具体的には、(1)培養肺細胞に対するSCGB3A2のアポトーシス抑制効果とそのメカニズムの解析と、(2)Scgb3a2遺伝子改変マウスを利用したアポトーシス、炎症、線維化に対するSCGB3A2の改善効果を検証することとした。
培養細胞系としてマウス肺線維症細胞株MLg細胞を肺線維症誘発物質であるブレオマイシン（BLM）で刺激した。この時、リコンビナントSCGB3A2（rSCGB3A2）の存在・非存在下でのアポトーシスの検討を行った。この結果、BLMにより誘導されたアポトーシスは、rSCGB3A2で有意に抑制された。
一方、Scgb3a2遺伝子変異マウスを用いた検討では、先行実験として、肺で高発現するScgb3a2トランスジェニック（TG）マウスと野生型マウスにBLMを投与し、その後の肺線維症の発症について病理学的に検討した。この結果、BLM投与による肺線維症の程度は野生型に比べScgb3a2TGマウス肺で軽度である傾向が見られた。
本年度の研究結果から、SCGB3A2は肺線維症の治療薬として有効である可能性が強く示唆された。特に動物実験における結果は非常に興味深い結果であったため、次年度はScgb3a2KOマウスも合わせ、BLM誘導性肺線維症におけるSCGB3A2の治療効果の検討を詳細に行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年度の計画として、(1) 培養肺細胞を用いたSCGB3A2のアポトーシス抑制効果の検討、(2) 肺器官培養システムを用いたSCGB3A2の肺組織構築促進効果の検討、(3) 肺線維症モデルマウスを用いたSCGB3A2の肺線維症抑制効果の検討を計画した。
SCGB3A2のアポトーシスの抑制効果(1)について、マウス肺繊維芽細胞株(MLg)をBLMで刺激し、アポトーシスを誘導させた時、rSCGB3A2添加によってアポトーシス陽性細胞数が有意に減少することをTUNEL法にて明らかにした。しかし、そのほかの方法での検討や、アポトーシス抑制経路の決定は次年度に行うこととなった。
肺器官培養システムを用いたSCGB3A2の肺組織構築促進効果の検討(2)では、器官培養条件の検討が完了したため、次年度にSCGB3A2の効果を検討できる環境が整った。
肺線維症モデルマウスを用いたSCGB3A2の肺線維症抑制効果の検討(3)については、平成24年度にScgb3a2遺伝子改変マウス（KO,TG）を米国より山形大学医学部附属動物飼育施設に移動し、SPF化および繁殖を開始できた。野生型およびTGの余剰マウスを用いて、先行実験を行った。それぞれのマウスにBLMを気管投与し、１週間後、および2週間後の肺組織の状態を組織学的に解析したところ、TGマウス肺の方が、野生型にくらべ線維症の進行が遅れる傾向が認められた。肺線維症におけるSCGB3A2の改善効果が期待できるものと判断できる結果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度の計画として、(1)培養肺細胞を用いたSCGB3A2のアポトーシス抑制効果の検討では、特に生物学的解析として、TUNEL法の他、Annexin V結合試験及びチトクロームC(CytC)局在解析により、SCGB3A2存在下・非存在下でBLM刺激したマウス肺線維芽細胞のアポトーシス抑制効果を解析する。これに加え、活性酸素種(ROS)抑制遺伝子類の解析として、BLM刺激によって放出されるROSを解析し、SCGB3A2のアポトーシス抑制効果を分子生物学的に検証する。SCGB3A2刺激によりROS抑制因子、抗酸化遺伝子（グルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキシン、SOD）発現が亢進した試料について、ROS抑制因子と抗酸化遺伝子の発現を定量RT-PCRを用いて解析する。
さらに、(2) 肺器官培養システムを用いたSCGB3A2の肺組織構築促進効果の検討として、マウス胚の肺器官培養系を用いて、肺組織構築に対するSCGB3A2の効果を調べる。培養液にBLMを添加し、器官培養系において組織レベルでの肺線維症モデルを構築し、最終的に、器官培養系でのSCGB3A2のアポトーシス抑制効果の解析行う。
動物実験として、(3)肺線維症モデルマウスを用いたSCGB3A2の肺線維症抑制効果の検討を行う。現在繁殖している野生型(WT)と肺上皮細胞特異的にScgb3a2を高発現させたScgb3a2 TGマウスおよびScgb3a2 KOマウスに対し、BLM投与により肺線維症を誘導し、BLMを投与後、1-4週間目にSCGB3A2の効果を調べる。具体的には、①生理機能検査、②気管支肺胞洗浄液(BALF)から回収された炎症細胞および肺胞マクロファージの解析、③病理学的解析肺上皮細胞、④間質系細胞、肺胞マクロファージのアポトーシスの程度の検討、⑤酸化ストレスの種類と抑制経路の検討、を計画している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
１）消耗品費（384,737円）：アポトーシス検出用キット（TUNEL、Annexin V結合試験など）、抗体、培養用試薬など（培地、血清、酵素など）
２）動物関係費（300,000円）：維持費（動物センター管理費用）、餌・床代、マウス購入費
３）旅費（450,000円）：日本動物学会（9月、岡山）、日本分子生物学会（12月、神戸）、日本生理学会（3月、鹿児島）
４）謝金（50,000円）：実験補助に対する謝金
５）その他（30,000円）：英文校正費用など
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[Journal Article] Pharmacological Stimulation of Type 5 Adenylyl Cyclase Stabilizes Heart Rate under both Microgravity and Hypergravity induced by Parabolic Flight2012
Author(s)
Bai Y, Tsunematsu T, Jiao Q, Jin M, Cai W, Jin H, Fujita T, Ichikawa Y, Suita K, Kurotani R, Yokoyama U, Sato M, Iwatsubo K, Ishikawa Y, Okumura S
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Journal Title
Journal of Pharmacological Sciences
Volume: 119
Pages: 381-389
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Analyses of respiration activity in single culture cells2012
Author(s)
Takakura K, Watanabe T, Sakahara S, Kurotani R, Abe H
Organizer
International Joint Symposium on Single-Cell Analysis (The 6th International Workshop on Approaches to Single-Cell Analysis & The 8th International Forum on Post-Genome Technologies)
Place of Presentation
Kyoto Research Park, Kyoto
Year and Date
20121127-20121128
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