第二のシスチン尿症関連輸送体の分子同定とその生理機能の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591198
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 永森 收志 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90467572)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大垣 隆一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20467525) ; 西園 啓文 富山大学, 学内共同利用施設等, 助教 (10502289)
• Keywords: トランスポーター / シスチン尿症 / 再構成系 / 機能共役 / 膜複合体 / プロテオミクス

Research Abstract

シスチン尿症(OMIM220100)は、腎近位尿細管のシスチン再吸収不全により生じる常染色体劣性の遺伝性疾患であり、rBAT（補助サブユニット）とb(0,+)AT（活性サブユニット）の二つのタンパク質からなるヘテロ二量体型シスチン輸送体の変異により発症するが、さらに未知のトランスポーターの関与が示唆されてきた。本研究は、b(0,+)ATと同じファミリーに属するトランスポーターSLC7A13が、長年不明であったrBATの第二の結合パートナーであり、尿細管シスチン再吸収に寄与するものであることを実証して、シスチン尿症の新規原因遺伝子候補を提示することを目的とした。平成25年度は、前年度に確立した精製タンパク質を用いたプロテオリポソーム再構成法を用いて、SLC7A13の基質選択性を輸送活性阻害試験によって解析した。さらに、SLC7A13の基質選択性とその輸送メカニズム解析とプロテオミクス解析の結果から、SLC7A13の生理的機能を明らかにする目的で、機能共役する他のアミノ酸トランスポーターを予測、同定を試みた。その結果、SLC7A13の基質の一部をナトリウム依存的に細胞内に取り込むアミノ酸トランスポーターとSLC7A13が尿細管S3分節において共局在していること、さらに2種のトランスポーターが近接して存在していることを明らかにした。これにより、S3分節においてSLC7A13が効率的にシスチン再吸収を行うメカニズムの一端が明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度に引き続き、精製タンパク質を用いたプロテオリポソーム再構成法を用いることで、SLC7A13の詳細な輸送機能解析を行った。22種類のアミノ酸を用いた取り込み試験に加え、10種類のアミノ酸誘導体を用いた阻害実験を行うことにより、SLC7A13の基質認識についての情報が得られた。さらに、SLC7A13がナトリウム依存的グルタミン酸トランスポーターEAAC1/SLC1A1と近位尿細管S3分節において近接して共局在していることを示したことにより、アミノ酸輸送におけるアミノ酸トランスポーター同士の機能共役によりシスチンの再吸収が行われていることが強く示唆される結果を得た。これは、尿細管物質輸送生理学にシスチン輸送の新しい分子を加えただけでなく、別々の輸送体が機能的複合体を形成し機能共役することで、輸送機能を発揮しているという概念を実証する結果であると考える。この機能的複合体は、多数の輸送体タンパク質と足場タンパク質からなる超複合体の一部である可能性を示唆する予備的結果が得られている。

Strategy for Future Research Activity

グルタミン酸トランスポーターEAAC1/SLC1A1との機能共役が示唆されたことから、機能的複合体の存在が考えられ、さらに物理的な超膜複合体を形成している可能性が示唆される。実際、予備的な検討からSLC7A13及びrBATが、グルタミン酸トランスポーターEAAC1/SLC1A1とは異なる他のトランスポーターと複合体を形成している結果が得られている。したがって、その複合体の実在を明らかにし、尿細管における物質の再吸収機能が、個々のトランスポーターの機能だけではなく、それらの機能共役を必要としていることを明らかにする。再構成系による機能解析に加え、超複合体の共免疫沈降実験、プロテオミクス解析を用いることで機能的もしくは物理的複合体の実態を明らかにし、さらにその複合体におけるSLC7A13の役割を解明する。
また、既に予備的検討で検出されている超複合体の中に見られるトランスポーターは、トランスポーター単独で培養細胞で発現させた際には機能を発現しない、もしくは弱い機能を示す因子が含まれていた。SLC7A13もまた、同様にrBAT との共発現だけでは培養細胞で十分な発現及び活性を示さない。このことは、近位尿細管のトランスポーターの機能発現に広く必要な新規因子の存在を示唆しており、尿細管物質輸送生理学における重要な発見となる可能性がある。この新規因子についても、プロテオミクス解析によって実体解明を進める。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究の進展により、当初予定していた動物を用いる実験よりもプロテオミクス解析や再構成実験を行ったため、動物施設使用料として計上していた一部が次年度使用額となった。
次年度においてもプロテオミクス解析や再構成実験を多く行う計画である。生じた次年度使用額高価なプロテオミクス試薬や質量分析計消耗品、界面活性剤の購入に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). (2014)
  • Author(s): Watashi K, Sluder A, Daito T, Matsunaga S, Ryo A, Nagamori S, Iwamoto M, Nakajima S, Tsukuda S, Borroto-Esoda K, Sugiyama M, Tanaka Y, Kanai Y, Kusuhara H, Mizokami M, Wakita T.
  • Journal Title: Hepatology Volume: Epub ahead of print Pages: Epub
  • DOI: 10.1002/hep.26982
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Annexin A4-conferred platinum resistance is mediated by the copper transporter ATP7A. (2014)
  • Author(s): Matsuzaki S, Enomoto T, Serada S, Yoshino K, Nagamori S, Morimoto A, Yokoyama T, Kim A, Kimura T, Ueda Y, Fujita M, Fujimoto M, Kanai Y, Kimura T, Naka T.
  • Journal Title: Int J Cancer Volume: Epub ahead of print Pages: Epub
  • DOI: 10.1002/ijc.28526
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical significance of L-type amino acid transporter 1 expression as a prognostic marker and potential of new targeting therapy in biliary tract cancer. (2014)
  • Author(s): Kaira K, Sunose Y, Ohshima Y, Ishioka NS, Arakawa K, Ogawa T, Sunaga N, Shimizu K, Tominaga H, Oriuchi N, Itoh H, Nagamori S, Kanai Y, Yamaguchi A, Segawa A, Ide M, Mori M, Oyama T, Takeyoshi I.
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: Epub ahead of print Pages: Epub
  • DOI: 10.1186/1471-2407-13-482
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nicotine induces dendritic spine remodeling in cultured hippocampal neurons. (2014)
  • Author(s): Oda A, Yamagata K, Nakagomi S, Uejima H, Wiriyasermkul P, Ohgaki R, Nagamori S, Kanai Y, Tanaka H.
  • Journal Title: J Neurochem Volume: 128 Pages: 246-255
  • DOI: 10.1111/jnc.12470
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] YY1 binds to α-synuclein 3'-flanking region SNP and stimulates antisense noncoding RNA expression. (2013)
  • Author(s): Mizuta I, Takafuji K, Ando Y, Satake W, Kanagawa M, Kobayashi K, Nagamori S, Shinohara T, Ito C, Yamamoto M, Hattori N, Murata M, Kanai Y, Murayama S, Nakagawa M, Toda T.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 58 Pages: 711-719
  • DOI: 10.1038/jhg.2013.90
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Glycolipozyme MPIase is essential for topology inversion of SecG during preprotein translocation. (2013)
  • Author(s): Moser M, Nagamori S, Huber M, Tokuda H, Nishiyama K.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci USA Volume: 110 Pages: 9734-9739
  • DOI: 10.1073/pnas.1303160110
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biological evaluation of 3-[(18)F]fluoro-α-methyl-D-tyrosine (D-[(18)F]FAMT) as a novel amino acid tracer for positron emission tomography. (2013)
  • Author(s): Ohshima Y, Hanaoka H, Tominaga H, Kanai Y, Kaira K, Yamaguchi A, Nagamori S, Oriuchi N, Tsushima Y, Endo K, Ishioka NS.
  • Journal Title: Ann Nucl Med Volume: 27 Pages: 314-324
  • DOI: 10.1007/s12149-013-0687-7
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アミノ酸トランスポーターと細胞内アミノ酸シグナリング (2013)
  • Author(s): 永森 收志
  • Organizer: 生理学研究所研究会「細胞センサーの分子機構・相互関連・ネットワーク研究会」
  • Place of Presentation: 岡崎、愛知
  • Year and Date: 20131128-20131129
  • Invited
• [Presentation] アミノ酸輸送体LAT1によって取り込まれたロイシンに対する細胞応答のリン酸プロテオミクスによる解析 (2013)
  • Author(s): 永森收志、Pattama Wiriyasermkul、世良田聡、仲哲治、金井好克
  • Organizer: 日本アミノ酸学会第７回学術大会
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 20131102-20131103
• [Presentation] A novel cystine transporter in S3 segment of the renal proximal tubule is an “unknown-partner” of Slc3a1 (rBAT) (2013)
  • Author(s): Shushi Nagamori, Pattama Wiriyasermkul, Meritxell Espino Guarch, Kazuhisa Okuyama, Saya Nakagomi, Kenijiro Tadagaki, Kazuaki Takafuji, Ryuichi Ohgaki, Manuel Palacín, Yoshikatsu Kanai
  • Organizer: 2nd HDP international symposium on Multi-Level Systems Biology
  • Place of Presentation: Marunouchi, Tokyo
  • Year and Date: 20130628-20130629
• [Presentation] Functional coupling of transporters in a complex
  • Author(s): Shushi Nagamori
  • Organizer: First Awaji International Workshop on “Electron Spin Science & Technology: Biological and Materials Science Oriented Applications”
  • Place of Presentation: Awaji, Hyogo
  • Invited
• [Presentation] 「がん細胞のアミノ酸トランスポーター」
  • Author(s): 永森收志、金井好克
  • Organizer: 第31回日本ヒト細胞学会学術集会 シンポジウム「分子標的診断・治療の進歩と今後」
  • Place of Presentation: 所沢、埼玉
  • Invited
• [Presentation] 日本人型シスチン尿症を発症させるアミノ酸トランスポーター変異体の機能解析
  • Author(s): 永森 收志、河本 泰治、Pattama Wiriyasermkul、金井 好克
  • Organizer: 生理学研究所研究会「上皮膜輸送の多層的コントロールによる生体の恒常性維持機構」
  • Place of Presentation: 岡崎、愛知
  • Invited
• [Presentation] Metabolomics and proteomics analyses of knockout mice reveal real physiological substrates of an organic anion transporter.
  • Author(s): Shushi Nagamori, Xi He, Taku Hirata, Pattama Wiriyasermkul, Saya Nakagomi, Takamasa Ishikawa, Tomoyoshi Soga, Yoshikatsu Kanai
  • Organizer: 第86回日本生化学会大会、International Session
  • Place of Presentation: 横浜、神奈川
  • Invited
• [Presentation] 膜輸送複合体におけるトランスポーターの機能共役
  • Author(s): 永森收志
  • Organizer: 第4回難治疾患共同研究拠点シンポジウム
  • Place of Presentation: お茶の水、東京
  • Invited
• [Presentation] Functional coupling of a urate-anion exchanger URAT1 and Na+-dependent anion transporter SMCT2 on a PDZK1 scaffold; Proposal of “Transportsome” for urate-transport
  • Author(s): Shushi Nagamori, Yasuhiro Umemura, Pattama Wiriyasermkul, Yumiko Nishinaka, Noriyoshi Isozumi, Yoshikatsu Kanai
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society
  • Place of Presentation: San Francisco､USA
• [Presentation] Evaluation of amino acid transporter LAT1 as a molecular target of anti-tumor therapy by means of the combination of comprehensive proteomics and transport assay網羅的プロテオミクスと輸送解析によるアミノ酸トランスポーター LAT1の抗腫瘍薬分子標的としての意義の検討
  • Author(s): 永森 收志、Pattama Wiriyasermkul、五十棲 規嘉、Pornparn Kongpracha、大垣 隆一、金井 好克
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台
• [Presentation] 網羅的定量オミクスによるトランスポーター研究の新しい展開 Comprehensive and quantitative "omics" bring up new world of transporter research
  • Author(s): 永森收志、金井好克
  • Organizer: 2014年度日本農芸化学会 シンポジウム「トランスポーターを通して見る生命現象」
  • Place of Presentation: 生田、東京
  • Invited