2013 Fiscal Year Research-status Report
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24591271
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
久保田 龍二 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (70336337)
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| Keywords | ウイルス / 感染症 / 動物 / HTLV-1 / HAM |
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| Research Abstract |
HAMの脊髄ではHTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL)が浸潤し、脊髄内でHTLV-1特異的炎症を起こしHAMが発症していると考えられている。HTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的CTLをマウスに移入することでHAM動物モデルを作成し、新規治療法開発のツールとすることが本研究課題であり、本年度は以下の研究を行った。
HLA-A2またはHLA-A24陽性のHAM患者のリンパ球を用いて、HTLV-1感染CD4陽性細胞株およびHTLV-1 Tax特異的CD8陽性CTL株の樹立を試みた。末梢血リンパ球よりCD4陽性細胞をマグネットビーズを用いて分離し、IL-2存在下で長期培養した。HTLV-1感染細胞株は昨年度の3株に追加して本年度は新たに3株の感染細胞株がえられた。
HTLV-1特異的CTL株については、同一患者の末梢血リンパ球よりCD8陽性細胞またはHTLV-1 Tax/MHCテトラマー陽性細胞をマグネットビーズで分離した。非感染者のリンパ球を3Gの放射線照射後ペプチドを添加し、上記のCD8陽性細胞またはHTLV-1 Tax/MHCテトラマー陽性細胞に添加後IL-2存在下で混合培養した。しかしながら、動物実験に用いるレベルの細胞数に達しなかった。そこで、添加IL-2の比較を行い、力価の高いIL-2を選別した。また、感染者の全リンパ球を培養しリンパ球自己増殖反応を起こさせた後、HTLV-1特異的CTLが約10倍以上に増加した状態でテトラマーにて陽性細胞を分収し、ビオチン化CD2、CD3、CD28を結合したマイクロビーズを刺激粒子として混合培養を行い、CTLの株化を行っている。現在2株が樹立されつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究課題の重要な点は、ヒトのHAMの脊髄で観察された浸潤HTLV-1感染CD4陽性細胞およびHTLV-1特異的CD8陽性細胞傷害性Tリンパ球（CTL)によるHTLV-1特異的炎症を両細胞を移入した動物の脊髄で再現し、これによりHAM発症モデルを作成し、さらに新治療法開発のツールとすることである。これを実現するためには、最低10の6乗オーダーの細胞数が必要になると考えられる。現時点ではHTLV-1感染CD陽性細胞株は十分な細胞数に達しているが、HTLV-1特異的CTL株は未だ十分な細胞数に達しておらず、本年度はマウスへの移入実験を行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在HTLV-1特異的CTL株は樹立されつつあるが、本実験の使用に耐えうる細胞数まで刺激を繰り返し、大量培養を行う。
次に大量培養したHTLV-1感染CD4陽性細胞株とHTLV-1特異的CD8陽性CTL株を、NOGマウスに腹腔内投与し、痙性対麻痺等の神経症状の観察を行う。症状発現が軽微な場合は、投与する細胞を活性化して用いる。また、HTLV-1ウイルス量の多いHAM患者のリンパ球全体をNOGマウスに投与し、脊髄症状を起こすか検討する。HTLV-1感染CD4陽性細胞のみ、HTLV-1 Tax特異的CTLのみ、または両細胞の投与で中枢神経症状の炎症細胞浸潤に差があるか免疫組織学的に検討する。次に脊髄症状をおこしたマウスを解剖し、各種抗体を用いた免疫組織学的検討を行い（CD3、CD4、CD8等）、中枢神経系に炎症細胞の浸潤があるのか、浸潤細胞はCD4およびCD8陽性細胞なのかを検討する。またTax/MHCテトラマーを用いて、中枢神経におけるHTLV-1特異的CTLを同定する。以上によりヒトのHAMとの相同性を組織病理学的に確認する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度は培養細胞が目的の細胞数にいたらず、動物実験を行うことができなかった。そのため当初予定していたマウスの購入は行わず、予定より使用した費用が少なかったため、次年度使用額が発生した。
平成26年度は、細胞株培養およびマウス購入代金が主要な用途となる予定である。また、動物モデル作成後の詳細な解析のために、各種抗体、MHCテトラマー、組織切片作成費等に使用予定である。
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