2012 Fiscal Year Research-status Report

劇症１型糖尿病の病因・病態の解明及び新たな治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	24591320
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	遠藤登代志山梨大学, 医学工学総合研究部, 准教授 (00152017)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	金重勝博山梨大学, 医学部附属病院, 助教 (20377518) 小林哲郎山梨大学, 医学工学総合研究部, 教授 (30113442) 田中昌一郎山梨大学, 医学工学総合研究部, 助教 (70377521) 滝澤壮一山梨大学, 医学工学総合研究部, 助教 (80456467)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	劇症１型糖尿病 / Amylaseα-2A / 自己抗体 / 慢性膵炎 / DNA 免疫
Research Abstract	劇症１型糖尿病は急激に発症する極めて重篤な糖尿病であり、その迅速な診断法としてAmylaseα-2A (AMY)に対する自己抗体(AMY-Ab)をELISA法にて検出することが有用であることを明らかにして来た。しかし、この測定法はbackgroundが比較的高く更に改良が必要であるため、Amylaseα-2Aを21～25アミノ酸からなるペプチドを合成し、これらを抗原としてELISAを行った。その結果、Amylaseα-2AのC末端に近いペプチド７を用いた際に、従来の結果がほぼ再現され、かつbackgroundが低下することが判明した。この改良ELISAにて種々の膵関連疾患の血中AMY-Abの有無を検討した結果、アルコール性慢性膵炎患者中に高率に検出され、また非アルコール性慢性膵炎患者中にも存在することが明らかとなった。後者は原因不明の慢性膵炎であり、新たな疾患の存在が示唆された。一方、AMY-Abの意義を明らかにする目的にて、AMYをマウスに免疫するモデルを開発中であるが、AMY cDNAをin vivo electroporation法にて免疫することにより高率に膵島炎を惹起しうることが判明した。現在、劇症１型糖尿病との関連を病理学的ならびに耐糖能の観点より解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ① ELISA改良：ペプチド７によるELISAはbackgroundを改善したが、目標には達成できていない。この原因はこのペプチドが難溶性であり、このためにinterassay variationが高くなる傾向があるためである。現在種々の溶媒にて検討しているため、劇症１型糖尿病での正確な AMY-Abの頻度・抗体価の検討に遅れが生じている。 ② 膵島炎モデルマウスの解析このモデルの作成に当初、E.coliにて産生したリコンビナントAmylaseα-2Aを抗原として使用したが、実験中にこれらに高濃度のエンドトキシンが含まれることが判明し、この影響は無視できないと考え、現在AMY-cDNAのDNA 免疫に方法を変更した。このために若干の遅れが生じているが、本法はエンドトキシンの影響を回避しうる方法であり膵島炎も生じるため、今後進展が期待される。
Strategy for Future Research Activity	① ELISA改良ペプチド７は抗原としては優れているが、これをELISAプレートにコートするELISAでは限界があるよと考えられる。そのため、ペプチド７とβ-galactosidaseの融合蛋白の作成、ないしペプチド７に対する家兎抗体を作成に２抗体法によるRIAないしELISAでの検出を検討している。 ② 膵島炎モデルマウスの解析現在、AMY-cDNAのDNA 免疫にてモデルが作成されており、今後CXCL-10やinterferon-γなどとの関連などの解明が期待される。これらによりAMY-Abと劇症１型糖尿病の関連や他の種々の膵疾患におけるAMY-Abの意義を明らかにする予定である。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	改良ELISA確立のため、TEKAN社マイクロプレートリーダー（サンライズリモート）を購入予定である。研究試薬、実験動物購入およびガラス器具等を購入する。