2013 Fiscal Year Research-status Report
骨代謝バランスとその破綻～ｐＨ受容体欠損マウスを用いた解析
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24591349
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
茂木 千尋 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (00375528)
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| Keywords | pH / 骨芽細胞 / 破骨細胞 |
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| Research Abstract |
骨量は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成とのバランスによって調節される。このバランスはホルモンやサイトカインなど細胞外の要因に影響されることはよく知られているが、細胞外プロトン（pH）も重要な役割を担っており、酸性条件下では骨吸収が亢進するといわれている。OGR1 (ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1)、TDAG8 (T-cell death-associated gene 8)、GPR4、G2A）は細胞外のpHを感知するGタンパク質共役型受容体であり、骨芽細胞および破骨細胞でも発現している。
平成24年度に行ったpQCTによる海綿骨の骨密度測定と、骨形態計測による結果から、pH受容体OGR1は骨芽細胞、破骨細胞機能を介して骨吸収を亢進していることが示唆されるが、破骨細胞もしくは骨芽細胞の機能とpHの関連については細胞レベルでの検討が必要である。そこで平成26年に計画していた細胞培養実験系の確立を前倒しで始めた。野生型、およびOGR1ノックアウトマウスより採取した骨髄細胞を、M-CSF、RANKLにより破骨細胞へ分化誘導を行った。また、骨代謝は骨芽細胞と破骨細胞のバランスにより調整されているため、共培養系の確立を行った。いずれも播き込み細胞数、細胞の状態、分化誘導開始から評価するまでの時間が重要であった。破骨細胞のマーカーとしてTRAP（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）陽性と多核形成、骨芽細胞のマーカーとしてALP（骨型アルカリホスファターゼ）を用い、活性染色をして形態観察を行った。多検体の評価のためにTRAPとALP活性の測定系の確立を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成24年度には出産のため産休を取得し、仕事を中断した。このため、マウスの飼育数が減り、平成24年度および平成25年度に予定していた骨密度の測定が未だ十分ではない。一方、個体レベルでの解析で得た結果を説明するために平成26年度は細胞レベルでの研究を計画していたが、培養実験については前倒しで着手することにし、条件検討など細胞レベルでの機能解析の準備ができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、pH受容体ノックアウトマウスを用いて、個体レベルおよび細胞レベルでの研究を通してpH受容体が骨代謝でどのような役割を果たすのかを明らかにすることを試みるものである。
個体レベルでは、平成24年度-25年度に計画していて十分に行えなかった個体レベルでの解析を行う。具体的には、(1) pH 受容体ノックアウトマウス脛骨を用いて骨形態計測を行う。サンプリング前に一定の期間を置いてカルセインを投与し、沈着したカルセインの距離を測定することにより骨の成長速度を調べる。骨芽細胞、破骨細胞の数や接する骨の面積など、骨の組織学的検討と測定から破骨細胞と骨芽細胞のそれぞれの機能を計測する。(2)骨代謝が破綻した病態モデルとして、pH 受容体ノックアウトマウスでコラーゲン関節炎(CIA)モデルを作成して、その増悪度をスコアリングにより評価する。(3)正常もしくは病態を誘導したマウスより血液を採取し、骨形成マーカー（骨型アルカリホスファターゼ）、骨吸収マーカー（I型コラーゲン架橋N-テロペプチド）、サイトカイン（TNF-α）をELISA 法により測定する。
さらにpHと女性ホルモンとの関連を細胞レベルで解析する。(1)マウス新生仔頭蓋冠より調製した骨芽細胞を用いpH 低下による骨形成に関わる活性（アルカリホスファターゼ、骨石灰化など）と破骨細胞を分化する活性（RANKL 発現）を評価する。 (2) M-CSF、RANKL により誘導される破骨細胞分化過程について、破骨細胞の形成と破骨細胞の骨吸収能（骨吸収窩の面積）に対するpHやエストロゲンの作用を調べる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24年度には出産のため産休を取得し、仕事を中断した。このため、マウスの飼育数が減り、平成24年度および平成25年度に予定していた骨密度の測定が十分にできていない。骨密度の測定および骨形態計測のために予定していた金額を次年度に繰り越した。
次年度使用額は骨密度測定および骨形態計測を行う予定である。骨密度の測定および骨形態計測には特殊な機器が必要なため専門の業者による測定が必要である。それ以外の実験については必要な機器や施設は揃っており設備備品の購入の予定はない。
細胞培養の実験に関しては、前倒しで開始した。平成26年度も細胞培養実験を行うので、分化誘導にサイトカイン類が、骨代謝機能の評価として専用の培養関連器具の消耗品が必要である。
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[Journal Article] Proton-sensing ovarian cancer G protein-coupled receptor 1 on dendritic cells is required for airway responses in a murine asthma model.2013
Author(s)
Aoki H, Mogi C, Hisada T, Nakakura T, Kamide Y, Ichimonji I, Tomura H, Tobo M, Sato K, Tsurumaki H, Dobashi K, Mori T, Harada A, Yamada M, Mori M, Ishizuka T, Okajima F.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 8
Pages: e79985
DOI
Peer Reviewed
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