Ｉｎ ｖｉｖｏヒト白血病発症モデルを用いたエピジェネティック関連遺伝子異常の解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591411
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 松下 弘道 東海大学, 医学部, 准教授 (50286481)
• Keywords: 急性骨髄性白血病 / DNMT3A / NPM1 / FLT3-ITD / 臍帯血由来CD34陽性細

Research Abstract

近年の網羅的遺伝子解析技術を用いた研究から、正常核型を有する急性骨髄性白血病（Acute myeloid leukemia: AML）の発症メカニズムとして、DNMT3A、IDH1/2、TET2などのepigenetic関連遺伝子に変異が生じること、それに引き続いてNPM1やFLT3-ITDなどの変異が生じること、全体として3－４個のdriverとなる遺伝子異常の蓄積があることがある。我々はこのAML発症メカニズムに興味を持ち、研究を進めてきた。
本年度は、昨年度作製したレトロウイルスベクターを用いて、in vitroおよびin vivoモデルの作製を試みた。主にDNMT3A-R882H変異を中心に検討を行ってきた。まず種々の非リンパ性白血病細胞株にこれを遺伝子導入した。HL60にDNMT3A-R882Hを導入したところ、コントロールベクターpMY-IRES-mOrangeを導入した場合に比し、CD11b mRNAおよびCD14 mRNAの発現は減少し、azacytidine存在下での細胞増殖能は増加した。しかし、U937やK562を用いた場合にはこの逆であり、一定の傾向が得られなかった。次に、臍帯血由来CD34陽性細胞に遺伝子導入した。これらの細胞を超免疫不全マウスであるNOGマウスに移植したが、長期の生着は得られなかった。現在、これらの細胞を用いて、コロニーアッセイや遺伝子発現変化などの検討を行っている。
FLT3-ITD変異については、K562およびHL60に導入し、Ara-C耐性を獲得することを確認した。さらにK562にFLT3-ITD変異を導入したK562/FLT3-ITDとコントロールであるK562/pMYからRNAを抽出してmicroarrayを行い、発現レベルが予後に関係する遺伝子について詳細に検討した。それにより、FLT3-ITDの下流で働く候補遺伝子を同定した。In vivoにおける検討では、NPM1変異とFLT3-ITD変異を同時に発現するベクターを導入したCD34陽性細胞をNOGマウスに移植したが、長期の生着は得られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在までのところ、in vivoの実験系については、DNMT3A-R882H単独、あるいはNPM1変異とFLT3-ITD変異を同時に発現するベクターを導入したCD34陽性細胞はNOGマウスに生着しておらず、正常核型を有するAMLのヒト化in vivoモデルの作製には至っていない。しかし、in vitroではDNMT3A-R882HとFLT3-ITDの単独の遺伝子導入によるphenotypeを確認することができた。特に臍帯血由来CD34陽性細胞に対する遺伝子導入効率については、マウスストローマ細胞株であるMS-5上で培養することにより約1.5倍まで増加できることを確認した。今後、IDH1・IDH2遺伝子変異、NPM1遺伝子変異およびTET2ノックダウンベクターなどについても遺伝子導入を行う予定であるが、この結果はそれらの至適な実験条件の設定に際し重要な参考データとなるものである。

Strategy for Future Research Activity

実験計画に従って、NPM1変異とFLT3-ITD変異を同時に発現するベクターとともにエピジェネティクスに関連した遺伝子異常を発現するベクターをヒトCD34陽性細胞へ感染させてNOGマウスへ移植し、白血病発症能につき検討を行う予定であるが、in vivo AMLモデルが作製できない場合に備え、これらの遺伝子異常を導入した細胞株、あるいはヒトCD34陽性細胞を用いたin vitroでの検討も同時に進めていく。具体的には、導入細胞における細胞増殖能や、コロニーアッセイによる各細胞系列への影響、抗がん剤感受性について、特にDNMT3A-R882Hなどepigeneticな遺伝子変異についてはDNAメチル化やそれに伴う遺伝子発現変化を検討することで、これらの遺伝子異常がどのように白血病発症に関与するか、可能であれば標的となりうる候補遺伝子の同定を試みる。これらの候補遺伝子の機能解析を行うとともに、臨床検体を用いてこれらの候補遺伝子の発現・変異解析を行い、頻度や治療反応性など実際の臨床における意義を明らかにしていく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

遺伝子導入によるin vitroおよびin vivoの表現系が十分に出なかったものがあり、pilot studyのレベルで実験を見直したため。
本年度は遺伝子解析などに関してより多くの予算が必要となると想定されるため、これに充当する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of the Body Fluid Mode of Automated Hematology Analyzer XN-Series for Extremely Low Peripheral White Blood Cell Counts (2014)
  • Author(s): Tanaka Y, Matsushita H, Tanaka Y, Maruki Y, Kondo T, Asai S, Miyachi H
  • Journal Title: Int J Lab Hematol Volume: 36 Pages: e3-7
  • DOI: 10.1111/ijlh.12114
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High Concentrations of L-Ascorbic Acid Specifically Inhibit the Growth of Human Leukemic Cells via Downregulation of HIF-1α Transcription (2013)
  • Author(s): Kawada H, Kaneko M, Sawanobori M, Uno T, Matsuzawa H, Nakamura Y, Matsushita H, Ando K
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8 Pages: e62717
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0062717. Print 2013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] RUNX1/AML1 mutant collaborates with BMI1 overexpression in the development of human and murine myelodysplastic syndromes (2013)
  • Author(s): Harada Y, Inoue D, Ding Y, Imagawa J, Doki N, Matsui H, Yahata T, Matsushita H, Ando K, Sashida G, Iwama A, Kitamura T, Harada H
  • Journal Title: Blood Volume: 121 Pages: 3434-3446
  • DOI: 10.1182/blood-2012-06-434423
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatosplenic T-cell lymphoma appearing in the peripheral blood (2013)
  • Author(s): Kojima M, Matsushita H
  • Journal Title: Blood Volume: 122 Pages: 1103
  • DOI: 10.1182/blood-2013-01-478404
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Atypical chronic myeloid leukemia harboring NUP98-HOXA9 (2013)
  • Author(s): Murayama H, Matsushita H, Ando K
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 98 Pages: 143-144
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1381-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 他に分類されない末梢性T細胞性リンパ腫 (2013)
  • Author(s): 松下弘道、田中由美子
  • Journal Title: 臨床検査 Volume: 57 Pages: 1628-1633
• [Presentation] Integrative genomic and proteomic analysis of low-dose ionizing irradiation effects on bone marrow stromal microenvironment and on survival of pre-leukemic cells (2013)
  • Author(s): Tabe Y, Jin L, Hatanaka Y, Matsushita H, Kazuno S, Fujimura T, Ueno T, Sasai K, Iwabuchi K, Andreeff M, Konopleva M, Miida T
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Functional analysis of SEPT9-ABL1 chimeric fusion gene derived from T-prolymphocytic leukemia (2013)
  • Author(s): Kawai H, Matsushita H, Suzuki R, Sheng Y, Lu J, Matsuzawa H, Yahata T, Kaneko M, Tsukamoto H, Kawada H, Ogawa Y, Ando K
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Molecular mechanisms of inhibition of ribosomal biogenesis and translational flux by the selective inhibitor of nuclear export (SINE) XPO1/CRM1 antagonist KPT-185 In mantle cell lymphoma (2013)
  • Author(s): Tabe Y, Kojima K, Jin L, Iwanami H, Matsushita H, Kazuno S, Fujimura T, Ueno T, Miida T, Andreeff M
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Efficacy and mechanisms of the mTOR inhibitor AZD2014 combined with L-asparaginase or JAK2 inhibitor TG101348 In ALL (2013)
  • Author(s): Tabe Y, Jin L, Iwanami H, Matsushita H, ,Kazuno S, Fujimura T, Ueno T, Miida T, Weinstock DM, Thomas DA, Andreeff M, Konopleva M
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Molecular mechanisms of adipocyte-leukemia interactions revealed by the quantitative proteomics technology: pro-survival function of adipocyte-derived free fatty acids on acute monoblastic leukemia mitochondrial biogenesis (2013)
  • Author(s): Tabe Y, Jin L, Kazuno S, Fujimura T, Matsushita H, Ueno T, Miida T, Andreeff, M, Konopleva
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Metabolic shift in hypoxia-adapted CML cells and mechanisms of acquired dasatinib resistance uncovered by proteomic iTRAQ profiling (2013)
  • Author(s): Tabe Y, Jin L, Iwanami H, Matsushita H, Kazuno S, Fujimura T, Ueno T, MiidaT, Andreeff M, Konopleva M, Kimura S
  • Organizer: 55th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] The role of FLT3-ITD in the chemoresistance of AML (2013)
  • Author(s): ダムディンスレン アナラ、松下弘道、浅井さとみ、宮地勇人
  • Organizer: 第60回 日本臨床検査医学会学術集会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場、神戸市
  • Year and Date: 20131031-20131103
• [Presentation] Downstream targets of FLT3-ITD in Ara-C resistance of leukemic cells (2013)
  • Author(s): Damdinsuren A, Matsushita H, Ito M, Tsukamoto H, Tanaka M, Hyashi H, Matsuzawa H, Asai S, Ando K, Miyachi H
  • Organizer: 第75回 日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌、札幌市
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] A diversity of cases in AML with promyleocytic differentiation; A report from JPLSG (2013)
  • Author(s): Takahashi H, Matsushita H, Kinoshita A, Taki T, Deguchi T, Kiyokawa N, Hashii Y, Hayashi Y, Tomizawa D, Taga T, Tawa A, Adachi S, Yabe M, Miyachi H
  • Organizer: 第７５回 日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌、札幌市
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] Chemotherapy prior to HSCT is beneficial for pediatric RAEB/RAEB-T (2013)
  • Author(s): Shimada A, Kinoshita A, Manabe A, Miyachi H, Matsushita H, Taki T, Inoue M, Hasegawa D, Hama A, Ito M, Tawa A, Kojima S, Adachi S
  • Organizer: 第７５回 日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌、札幌市
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] Functional analysis of SEPT9-ABL1 chimeric fusion gene derived from T-prolymphocytic leukemia (2013)
  • Author(s): Kawai H, Matsushita H, Suzuki R, Sheng Y, Lu J, Yahata T, Matsuzawa H, Tsukamoto H, Kawada H, Ogawa Y, Ando K
  • Organizer: 第７５回 日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌、札幌市
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] 当院におけるCD34、HLA-DR陰性AML38例の検討 (2013)
  • Author(s): 日下拓、二見恭子、星かおり、坂入和豊、田中由美子、浅井さとみ、松下弘道、矢部みはる、安藤潔、 宮地勇人
  • Organizer: 第14回 日本検査血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル、東京
  • Year and Date: 20130727-20130728
• [Presentation] AML with myelodysplasia-related changes (AML/MRC)における骨髄異形成と後天性染色体異常の関係について (2013)
  • Author(s): 荒川聡、権藤和美、増川敦子、大島利夫、浅井さとみ、松下弘道、矢部みはる、宮地勇人
  • Organizer: 第14回 日本検査血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル、東京
  • Year and Date: 20130727-20130728
• [Presentation] 総合血液学検査装置ADVIA2120を用いた血小板関連項目における基礎的検討 (2013)
  • Author(s): 小笠原篤、二見恭子、和田典子、田中由美子、松下弘道、宮地勇人
  • Organizer: 第14回 日本検査血液学会学術総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル、東京
  • Year and Date: 20130727-20130728
• [Presentation] 血液総合診断システムの運用と展開 (2013)
  • Author(s): 宮地勇人、矢部みはる、浅井さとみ、蟹由公子、田中由美子、松下弘道
  • Organizer: 第14回 日本検査血液学会学術総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル、東京
  • Year and Date: 20130727-20130728
• [Presentation] 炎症指標としての血算・血液像検査の利用状況（臨床医の意識調査結果） (2013)
  • Author(s): 山本剛正、石井清、三宅一徳、岩崎陽介、増田亜希子、松下弘道、堀井隆、佐藤尚武、田部陽子、大坂顯通
  • Organizer: 第14回 日本検査血液学会学術総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル、東京
  • Year and Date: 20130727-20130728
• [Presentation] 慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL1の多様性と測定上の技術的課題 (2013)
  • Author(s): 宮地勇人、増川敦子、宮澤美紀、荒川聡、大島利夫、浅井さとみ、松下弘道
  • Organizer: 第20回 日本遺伝子診療学会大会
  • Place of Presentation: アクトシティー浜松コングレスセンター、浜松市
  • Year and Date: 20130718-20130720
• [Presentation] SEPT9-ABL1融合遺伝子による白血病発症機構と治療反応性
  • Author(s): 松下弘道、川井英嗣、安藤潔
  • Organizer: 第18回 造血器腫瘍研究会
  • Place of Presentation: がん研究会がん研究所、東京