同種造血幹細胞移植後の効率的免疫寛容の誘導法の開発

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591425
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 谷本 光音 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10240805)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 嘉信 岡山大学, 大学病院, 助教 (60403474)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: GVHD

Research Abstract

本研究ではマウス同種骨髄幹細胞移植モデルを使い、皮膚上皮細胞のPD-L1発現が低下することにより、免疫寛容が破綻し慢性GVHDが発症することを明らかにするため以下の実験を行った。マウス慢性GVHDモデルには、最も汎用されるドナーにB10.D2、ホストにBALB/cを使ったマイナー抗原不一致移植マウスモデルを用いた。B10.D2の大腿骨から採取した骨髄細胞からT細胞(CD90+)をautoMACSによって除きT細胞除去骨髄幹細胞（TCD BM 5x10e6）を用意。B10.D2マウスの脾臓からT細胞（1x10e6）を採取し、レシピエントBALB/cに致死的放射線11Gyで前処置し、ドナー骨髄幹細胞およびT細胞を移植した。その結果慢性GVHDが発生することを組織学的にも確認し、慢性GVHDが発症した皮膚上皮細胞からmRNAを抽出しRT-PCRにて発現を検討した。PD-L1発現、移植直後が最も強くその後慢性GVHDが発症する時期に低下傾向であることが明らかとなった。次にPD-L1抗体を投与することにより慢性GVHDが悪化すること、さらにPD-L1ノックアウトマウスをレシピントにして移植することによりコントロール群と比べ有意に慢性GVHDが増悪することが明らかとなった。以上からPD-L1発現が慢性GVHD発症に関与していることが明らかとなった。
これまでホスト側の上皮系細胞の面から慢性GVHDをとらえた研究はなく、本研究は全く新しい角度からのアプローチである。つまりGVHDの病態を１）皮膚上皮細胞の障害→２）Treg誘導の低下→３）細胞障害性T細胞の増加→１）皮膚上皮細胞の障害という悪循環としてとらえた概念に基づいている。今後PDL1を介した治療応用が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究ではマウス同種骨髄幹細胞移植モデルを使い、皮膚上皮細胞のPD-L1発現が低下することにより、免疫寛容が破綻し慢性GVHDが発症することを明らかにするため以下の実験を行った。まず、マウス慢性GVHDモデルには、最も汎用されるドナーにB10.D2、ホストにBALB/cを使ったマイナー抗原不一致移植マウスモデルを用い、慢性GVHDが発生することを組織学的にも確認できた。この慢性GVHDが発症した皮膚上皮細胞からmRNAを抽出しRT-PCRにて発現を検討した結果、PD-L1発現は移植直後が最も強くその後慢性GVHDが発症する時期に低下傾向であることが明らかにした。さらにPD-L1抗体を投与することにより慢性GVHDが悪化すること、PD-L1ノックアウトマウスをレシピントにして移植することによりコントロール群と比べ有意に慢性GVHDが増悪することが明らかとなった。以上からPD-L1発現が慢性GVHD発症に関与していることが明らかとなった。以上のように、計画はおおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

PD-L1発現が慢性GVHD発症に関与していることが明らかとなったが、今後は、さらに血液系細胞か上皮系細胞に発現しているPD-L1のどちらが重要であるかは、キメラマウスを作製することによって検討する。つまりT細胞を除去した骨髄のみを移植し２月間経過したマウスは、血液系細胞はドナーに、上皮系細胞はホスト由来のキメラとなる。このキメラマウスをレシピエントに使用することにより、両者の役割を明確にする。また、慢性GVHDが発症した皮膚上皮細胞における RANKL の発現を免疫染色；Cytokeratin, RANKL を病変皮膚組織で染色する、またはRT-PCRにて定量化し評価する。皮膚Langerhans 細胞におけるRANK発現も免疫染色；RANK, langerin, MHC classIIの発現を検討する。次にMometason fuorateによって、Langerhans 細胞を除去することによりTregの誘導が阻害される結果、健常移植マウスにGVHDが誘導されるかを検討する。これによって、Langerhans 細胞のGVHDへの関与がより明確になると考えられる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

１、前年からの繰越分について
予定していた研究計画を一部翌年に持ち越したためその分を平成２５年度経費として消耗品費として計上予定
２、次年度の研究費ほ使用計画について
上記の今後の研究の推進に、マウス購入・維持関連640（千円）、抗体関連140（千円）、ガラス・プラスチック器具類120（千円）、細胞培養試薬200（千円）、細胞培養用牛胎児血清100（千円）調査研究旅費300（千円）、を使用予定している。

Research Products

• [Presentation] B7H1 expression on recipient regulate the frequency of IL-17+ IFNg+ T cells and contribute to the pathogenesis of cGVHD. (2013)
  • Author(s): H Fujiwara, K Kobayashi, H Nishimori, M Nishinohara, S Okamoto, K Matsuoka, E Kondo, N Fujii, K Shinagawa, M Tanimoto and Y Maeda.
  • Organizer: ASBMT tandem meeting
  • Place of Presentation: Solt lake cuty, USA
  • Year and Date: 20130214-20130218