血友病Ａインヒビター制御を目的とした人工多能性幹細胞の応用

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591430
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 講師 (70296119)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 英司 自治医科大学, 医学部, 研究員 (00245044) ; 大森 司 自治医科大学, 医学部, 講師 (70382843)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 血友病 / インヒビター / 免疫寛容 / 人工多能性幹細胞 / 遺伝子治療 / 細胞療法

Research Abstract

本研究は、血友病インヒビターの制御法の開発を主目的とし、インヒビター誘導第VIII因子欠損マウス（血友病Aマウス）を疾患モデルに用い、自己体細胞由来人工多能性幹細胞（iPS細胞）の細胞移植が第VIII因子抗原特異的な免疫寛容をもたらしインヒビターの発症を抑制する可能性とその制御機序を細胞レベルで探索するものである。１）血友病Aマウスから皮膚線維芽細胞を単離し、初期化４因子であるOct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc遺伝子、およびc-Mycを除いた3因子の遺伝子の導入を行い、4因子誘導から30コロニー、3因子誘導から6コロニーを得ることができた。２）得られたコロニーを20継代以上培養し、ES様形態、ALP染色、SSEA-1発現、Nanog, Eras, Fbx15,Oct3/4 などのmRNAの発現を確認し、iPS細胞の検証を行った。３）SIVベクターに完全長ヒト第VIII因子cDNAとB domain deleted第VIII因子 cDNAを組み込むとともに、これらの5’側上流にCMVおよびEF-1alpha プロモーター、あるいはautoimmune regulator （AIRE）、cadherin 5、CD68などの細胞特異的プロモーターを配置したコンストラクトを作製した。さらにトレーサー実験を目的としたEGFPcDNAおよびluciferase cDNAを組み込んだコンストラクトを同時に構築し、これらすべてについてSIV化を終了させた。４）EF-1alphaプロモーターを用いることにより樹立した第VIII因子由来iPS細胞でEGFPの持続な高発現細胞が得られること、AIREプロモーターがマウス胸腺上皮細胞株IT-76MHC細胞（東北大学伊藤恒教授より供与）において特異的なluciferase活性が誘導されることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画どおりに、血友病AマウスからのiPS細胞の樹立、遺伝子導入を目的とした完全長ヒト第VIII因子搭載SIVウイルスベクターの作製を終了し、次年度以降のin vitroおよびインヒビター誘導血友病Aマウスモデルを用いた研究へ展開する準備を完了したため。

Strategy for Future Research Activity

血友病Aインヒビター発症の予防と治療に繋げる新規方策を開発するため、血友病Aマウス個体における免疫応答の制御を目的に胸腺組織への選択的なiPS細胞移植法を具現化する。特にiPS細胞から胸腺上皮細胞への分化誘導系の検討、SIVベクターを用いたiPS細胞へのヒト完全長第VIII因子遺伝子導入法の確立、さらにヒト第VIII因子を発現する血友病Aマウス由来iPS細胞のマウス胸腺組織への細胞移植法に研究を展開する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし

Research Products

• [Journal Article] Overexpression of factor VII ameliorates bleeding diathesis of factor VIII-deficient mice with inhibitors. (2013)
  • Author(s): Yasumoto, A., S. Madoiwa, Y. Kashiwakura, A. Ishiwata, T. Ohmori, H. Mizukami, K. Ozawa, Y. Sakata and J. Mimuro
  • Journal Title: Thromb Res. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2013.03.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Evaluation of hemostatic biomarker abnormalities that precede platelet count decline in critically ill patients with sepsis (2013)
  • Author(s): Koyama, K., Madoiwa, S., Tanaka, S., Koinuma, T., Wada, M., Sakata, A., Ohmori, T., Mimuro, J., Nunomiya, S. and Sakata, Y.
  • Journal Title: J Crit Care Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.jcrc.2012.10.069
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Minimizing the inhibitory effect of neutralizing antibody for efficient gene expression in the liver with adeno-associated virus 8 vectors (2013)
  • Author(s): Mimuro, J., Mizukami, H., Hishikawa, S., Ikemoto, T., Ishiwata, A., Sakata, A., Ohmori, T., Madoiwa, S., Ono, F., Ozawa, K. and Sakata, Y.
  • Journal Title: Mol Ther Volume: 21 Pages: 318-323
  • DOI: 10.1038/mt.2012.258
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Porcine model of hemophilia A (2012)
  • Author(s): Kashiwakura, Y., Mimuro, J., Onishi, A., Iwamoto, M., Madoiwa, S., et al.
  • Journal Title: PloS one Volume: 7 Pages: e49450
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0049450
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tissue plasminogen activator deficiency promotes early phase regeneration in the olfactory epithelium after bulbectomy (2012)
  • Author(s): Makino, N., Madoiwa, S., Ohmori, T., Katoh, K., Ookawara, S., Kanazawa, T., Matsuo, O., Ichikawa, M., Mimuro, J., Ichimura, K. and Sakata, Y.
  • Journal Title: Int Forum Allergy Rhinol Volume: publised online Pages: publised on web
  • DOI: 10.1002/alr.21124
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Morphological assessment of the luminal surface of olfactory epithelium in mice deficient in tissue plasminogen activator following bulbectomy (2012)
  • Author(s): Makino, N., Ookawara, S., Madoiwa, S., Ohta, Y., Ishikawa, T., Katoh, K., Takigami, S., Kanazawa, T., Matsuo, O., Ichikawa, M., Mimuro, J., Sakata, Y. and Ichimura, K.
  • Journal Title: J Laryngol Otol Volume: 126 Pages: 1114-1120
  • DOI: 10.1017/S002221511200206X
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Acquired hemophilia A caused by factor VIII inhibitors: report of a case (2012)
  • Author(s): Hosoya, Y., Matsumura, M., Madoiwa, S., Zuiki, T., Matsumoto, S., Nunomiya, S., Lefor, A., Sata, N. and Yasuda, Y.
  • Journal Title: Surg Today Volume: published online Pages: publised on web
  • DOI: 10.1007/s00595-012-0290-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Intra-articular injection of mesenchymal stem cells expressing coagulation factor ameliorates hemophilic arthropathy in factor VIII-deficient mice (2012)
  • Author(s): Kashiwakura, Y., Ohmori, T., Mimuro, J., Yasumoto, A., Ishiwata, A., Sakata, A., Madoiwa, S., Inoue, M., Hasegawa, M., Ozawa, K. and Sakata, Y.
  • Journal Title: J Thromb Haemost Volume: 10 Pages: 1802-1813
  • DOI: 10.1111/j.1538-7836.2012.04851.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Il2rg gene-targeted severe combined immunodeficiency pigs (2012)
  • Author(s): Suzuki S, Iwamoto M, Saito Y, Fuchimoto D, Sembon S, Suzuki M, Mikawa S, Hashimoto M, Aoki Y, Najima Y, Takagi S, Suzuki N, Suzuki E, Kubo M, Mimuro J, Kashiwakura Y, Madoiwa S, et al.
  • Journal Title: Cell Stem Cell Volume: 10 Pages: 753-758
  • DOI: 10.1016/j.stem.2012.04.021
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] FTY720 improves functional recovery after spinal cord injury by primarily nonimmunomodulatory mechanisms (2012)
  • Author(s): Norimatsu, Y., Ohmori, T., Kimura, A., Madoiwa, S., Mimuro, J., Seichi, A., Yatomi, Y., Hoshino, Y. and Sakata, Y.
  • Journal Title: Am J Pathol Volume: 180 Pages: 1625-1635
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.12.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lack of association between serum paraoxonase-1 activity and residual platelet aggregation during dual anti-platelet therapy (2012)
  • Author(s): Ohmori, T., Yano, Y., Sakata, A., Ikemoto, T., Shimpo, M., Madoiwa, S., Katsuki, T., Mimuro, J., Shimada, K., Kario, K. and Sakata, Y.
  • Journal Title: Thromb Res Volume: 129 Pages: e36-40
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2011.10.033
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Immune response against serial infusion of factor VIII antigen through an implantable venous-access device system in haemophilia A mice (2012)
  • Author(s): Madoiwa, S., Kobayashi, E., Kashiwakura, Y., Sakata, A., Yasumoto, A., Ohmori, T., Mimuro, J. and Sakata, Y.
  • Journal Title: Haemophilia Volume: 18 Pages: e323-330
  • DOI: 10.1111/j.1365-2516.2011.02686.x
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Regulation of plasminogen activator inhibitor-1 promotes immune tolerance to factor VIII in murine hemophilia A (2013)
  • Author(s): Madoiwa S, Ohmori T, Kashiwakura Y, Sakata A, Mimuro J, Sakata Y
  • Organizer: the XXIV Congress of the ISTH
  • Place of Presentation: Amsterdam, Netherland
  • Year and Date: 20130703-20130703