2014 Fiscal Year Annual Research Report
ジンクフィンガーによる相同組換えを用いたライソゾーム病に対する遺伝子治療研究
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24591527
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
小林 博司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (90266619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
嶋田 洋太 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (20560824)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Zinc Finger / Krabbe病 / GALC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
準備段階としてKrabbe病モデルマウス遺伝子の遺伝情報（シークエンス）から疾患の原因となる点変異（12番染色体エクソン10）を相同組換えにより特異的に改善するためのdonor plasmid（DP)をデザインし調整、更に相応するZinc Finger Nuclease（ZFN)を計画通りSigma社に外注した。
まずKrabbe病モデルマウスのシュワン細胞由来の細胞株に対し Nucleofecta（エレクトロポレーション装置）を用いてZFN,DPをコトランスフェクションし ZFNによる相同組換え状況を検討した。 その結果シークエンス解析によりターゲットとした点変異の正常化が見られ Krabbe病の欠損酵素であるGALCの酵素活性が元の細胞と比較して導入細胞で有意に上昇(p=0.0208)、同時に蓄積物質サイコシンの低下が見られた。この結果は培養を持続しある程度継代しても維持された。
次にZFNにより相同組換えされた細胞をセレクションするためにGFP(green fluorescent protein)とGALCおよびピューロマイシン耐性遺伝子を同時発現する新たなDPをデザインし同様に導入したところ、GFP陽性細胞が見られ、陰性細胞を抗生物質で排除し選択的に培養を継続している。 更にTwitcher mouse由来のiPS細胞を樹立し 同様の手法でZFNによる相同組換えおよび選択的培養を試みている。
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