皮膚リンパ腫に対するエピジェネティクスを基盤とした併用療法の効果と作用機序の解析

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591636
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 坪井 良治 東京医科大学, 医学部, 教授 (70221421)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 皮膚リンパ腫 / エピジェネティクス

Research Abstract

ヒトT細胞株として、菌状息肉症由来のMJ、Myla、セザリー症候群由来のSeAx、HH、HUT78を使用。それぞれのCTCL株のRARβ2の発現をmRNAレベル、タンパクレベルで確認をした。
CTCL株のRARβ2発現が弱い場合を考慮して、RARβ2のプロモーター領域にTATAboxを含むluciferase遺伝子発現ベクターを作製し、その発現ベクターをCTCL株にtransfectionすることにより、生体マウス内でRARβ2の再発現や抗腫瘍効果を経時的に観察できるようにした。
HDACiとしてMS-275(entinostat)、ボリノスタットを使用し、レチノイド関連としてAm80(tamibarotene)、ベキサロテンを使用する。次に、以下のin vitroの実験を行った。①コロニー形成アッセイ：6ウェルプレートに200-400個のTリンパ腫細胞を撒き、各薬剤を3日間投与した後、培養液から薬剤を除き１～2週間後に形成されたコロニー数を数える。②XTTアッセイキットを用い、増殖抑制効果を検討する。③AnnexinV抗体を用いてFACSでアポトーシス誘導効果について検討する。④細胞周期解析キットを用いてFACSで細胞周期停止効果について検討する。
In vitroアッセイにて相乗効果が認められた薬剤の組み合わせで処理したCTCL細胞株をホモジネートし、磁気ビーズと結合させた抗アセチル化ヒストン3と4抗体とそれぞれ反応させ、chromatin immunoprecipitation(ChIP)を行う。磁気ビーズ回収後にRARβ2のreal time PCRを行い、処理前の値と比較することによりヒストンのアセチル化を証明。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

大幅な実験計画の変更もなく、つつがなく進行しているため。

Strategy for Future Research Activity

HDACiおよびレチノイドの単独ないし併用療法によるin vivo抗腫瘍効果の検討
平成24年度の実験から最も併用効果が高く、RARβ2の発現の回復が得られた薬剤の組み合わせを選ぶ。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

実験用試薬、器具等の物品費に使用予定。