ｉＰＳ細胞を利用してアトピー性皮膚炎におけるフィラグリンの関わりを評価する試み

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24591651
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 井川 健 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (00372441)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ヒト / 人工ヌクレアーゼ / Cas9/CRISPR / TALENs / アトピー性皮膚炎 / フィラグリン

Outline of Annual Research Achievements

hiPS細胞における遺伝子のターゲッティングは、マウスESあるいはiPS細胞におけるそれに比してかなり困難とされているが、近年の技術の進歩により、人工ヌクレアーゼを使用することによる遺伝子ターゲティング法により、比較的自在に行うことができるようになった。本研究においても、当初、通常のhomologous recombinationに期待するターゲティングを想定していたが、TALENsあるいはCas9/CRISPRを使う方向へと変更した。本来の目的である、アトピー性皮膚炎において実際にみられる遺伝子変異挿入を行う前に、フィラグリン遺伝子のノックアウトを目的として、実験を進行した。まず、TALENsを作成し（FLG-TALENs）、フィラグリン遺伝子のKOを試みたが、遺伝子切断の効率の問題か、うまくいかなかった。したがって、効率という面ではおおきなアドバンテージをもつCas9/CRISPRを使うことにした。web baseで標的とする配列（guide RNA）デザインしてベクターを作製した。作製したベクターをhiPS細胞にリポフェクションにより導入し、短期間の抗生剤セレクションを施行したのちに残存したコロニーをランダムに20個ピックアップした。20個のうち、5個ほどで片アレルにランダムな変異がみつかり、フィラグリン遺伝子に変異が挿入されたhiPS細胞を得た。


Cas9/CRISPRのシステムを使うことによって、フィラグリン遺伝子変異をもつhiPS細胞を作製することができた。このiPS細胞を用いて、フィラグリン遺伝子変異のもつ意味を詳細に検討可能となる。

Research Products

• [Journal Article] Removal of reprogramming transgenes improves the tissue reconstitution potential of keratinocytes generated from human induced pluripotent stem cells. (2014)
  • Author(s): Igawa K, Kokubu C, Yusa K, Horie K, Yoshimura Y, Yamauchi K, Suemori H, Yokozeki H, Toyoda M, Kiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H, Umezawa A, Katayama I, Takeda J.
  • Journal Title: Stem Cells Transl Med. Volume: 3 Pages: 992-1001
  • DOI: 10.5966/sctm.2013-0179.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant