2012 Fiscal Year Research-status Report
精神疾患患者由来試料におけるハイドロキシメチルシトシンのゲノムマッピング
| Project/Area Number |
24591676
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
文東 美紀 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00597221)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | エピジェネティクス |
|---|
| Research Abstract |
I. 健常者死後脳からの神経細胞由来の核画分調整
条件検討を行うために、まず健常者の死後脳1名分を使用して実験を行った。脳組織をホモジナイズ後、パーコール密度勾配遠心法を用いて、生化学的に細胞核画分を調整した。蛍光色素Alexa Fluor 488で標識した、神経細胞の核を特異的に検出する抗NeuN抗体を用いて、核画分の染色を行った。セルソーター（BD社製FACSAria II）を使用し、NeuN陽性核を分画後、神経細胞分画としてDNAを調整した。また、同様にNeuN陰性核を、非神経細胞分画としてDNAを調整した。
II. ビオチンーアビジン系を用いた5-ハイドロキシメチルシトシン(5-hmc)を含むDNA断片の濃縮
得られたDNAをCovaris社製のアコースティックソルビライザーを用いて断片化を行った後、5-hmcのグルコシル化およびビオチン付加を行い、アビジンビーズを用いて5-hmcを含むDNA断片の濃縮を行った。
III. 次世代シーケンサーを用いた配列決定
得られた5-hmc DNA断片は、アダプターに適切なタグをつけ増幅を行うことにより、シーケンス用のライブラリーを作製した。次世代シーケンサー（Illumina社製HiSeq）を用いて、シークエンス情報を得る時点まで終了している。現在、得られたリードに関して厳密なquality control後、ヒトゲノム参照配列にマッピングを行い、適切なpeak callアルゴリズムを用いて5-hmc化領域を決定している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
24年度に予定していた死後脳からの細胞核調製、NeuNマーカーによる神経・非神経由来核のソーティング、5-hmcを含むDNA断片の調製までは終了しており、25年度分に予定していた次世代シーケンサーによる解析も一部前倒しで始めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
I. 配列情報の解析
1) 5-メチルシトシン領域の情報を加味した解析。既に取得済みの5-メチルシトシン領域と、新たに得られた5-hmc領域の重複度合いや、量比などについて解析を行う。また、健常者と比較して変異が認められている5-mc領域に関して、その近傍の5-hmc修飾状態を定性的・定量的に解析を行う。2)全5-hmc量についての解析。患者・健常者について染色体ごと、あるいはより微細な染色体構造領域ごとに分割して比較を行い、5-hmc領域の量的な差異が体系的に認められるかどうかを検討する。3)領域特異的5-hmc変異についての解析。特定のゲノム領域について、患者群での変動が有意に認められるか、統計的に解析を行う。
II. 領域特異的な5-hmc変異の検証実験
現在のところ領域特異的な5-hmc変異の標準的な定量法は存在しない。申請者らは5-hmcを含む配列を認識して切断する制限酵素PvuRts1Iと、定量PCRを組み合わせた定量系を確立している。本実験系を用いて、領域特異的な5-hmc変異についての検証実験を行う。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬120万円、分子生物学用試薬30万円を使用予定である。
|
Research Products
(7 results)
