2013 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリアを標的とした放射線および温熱細胞死の増強と分子機構の解明
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24591835
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
趙 慶利 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (90313593)
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| Keywords | 温熱 / 放射線 / 細胞死 |
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| Research Abstract |
平成２５年は
１. Caspaesの活性化・不活性化の検出 (１) Apoptosisにおいて、initiator caspses-8, -2と-9のどの分子の活性化がeffector caspase-3を活性化させることについて実験で観察して部分的にかめいした。 (２)併用ではニトロキシドがcaspasesの活性部位SHを酸化し、すべてのcaspasesを不活化することが予測され、mitochondrial dysfunctionがapoptosisをautophagic cell deathにスイッチすることを確認した。
２. Mitochondrial permeabilization (MOMP) とcytochrome c (Cytc)の遊離 (１) apoptosisを誘発する単独と併用の系で、Baxのmitochondria (MT)への転位によるCytc遊離を確定した（Western blot, 免疫染色）。(２)併用によるnon-apoptotic cell deathにおいて、Bax/Bakの活性化、tBid生成、MOMPによるCytc遊離がおこるか、否かがapoptoticとnon-apoptotic deathの分別に重要であるので、生化学的手法と免疫染色で確定した。
３. MTのETC電子伝達とATP合成は生理的に必須である。(１)MTの機能低下の指標としてのミトコンドリア膜電位（H+勾配）はTMRMで測定した。HeLa細胞において併用時にzVAD-fmk抵抗性ミトコンドリア膜電位消失をおこす可能性を検討した。 (２)機能障害の指標としてのATP量の測定：apoptosis, necrosis とautophagy細胞の細胞のATP量を測定し、MT機能障害と細胞死の関係を部分できに解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の目的を中心にして、ほぼ計画のどおりで遂行している。25年度の計画のうち細胞死に対してCaspasesの活性化およびミトコンドリアの機能に関連する実験についてはほぼ完成し計画どおりである。その他の計画についてもほぼ計画どおり実施できている。したがって、現在までの達成度は95％以上と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２６年度研究について以下のどおりで遂行する。
１.分子シャペロンHSPsの発現と温熱／Tempoの感受性：HSPsの発現は癌細胞によって異なる。U937細胞では44℃/10分処理はHSP70を誘導するが、44℃/30分処理は逆に阻害することを観察した。その他の癌細胞（Jurkat-T, Molt-4, THP-1, HL-60とHeLa）において、(１)温熱とニトロキシドの単独・併用後に誘導性HSP27, HSP70と非誘導性のHSP90の発現（Western blot）と細胞死感受性の相関癌細胞差を検索する。(２)GeldanamycinはHSP90のATP pocketに結合し、heat shock factor 1 (HSF1) を活性化する。ストレス応答転写因子HSF1の活性化はHSP27とHSP70誘導を促進する。温熱とニトロキシドの単独・併用によるHSF1活性化とHSP27とHSP70の誘導発現の有無および細胞死への影響を検索する。(３) HSP70とHSP90のシャペロン機能がMOMPを保護する標的ミトコンドリア蛋白質を免疫沈降によって同定を目指す。
２.細胞内Ca2+の動態とmitochondrial permeability transition pore (PTP)変化 HeLa細胞での放射線、温熱、Tempoまたは併用後のCa2+動態とMTのCa2+ overloadについては明らかではない。(１) 細胞内Ca2+の上昇をFura-2-AM蛍光試薬を画像解析装置で定量し、MT matrixへのCa2+蓄積はRhod-2-AM蛍光画像で解析する。(２) MT内膜透過性（PTP開口）はmatrix Ca2+ overloadが主因と言われているので、Calcein-AMの蛍光画像によってCa2+に依存するPTP開口、ミトコンドリア膜電位の消失、Cytc遊離と細胞死（apoptosis, autophagic cell death）との関連を明らかにする。さらに、BAPTA-AM やRuthenieum redによってmatrix Ca2+ uptakeを阻害したとき、PTP (calcein法)、Cytc遊離と細胞死の抑制も検討し、Bax/Bak依存性MOMPによるapoptosisとCa2+依存性MT内膜透過（PTP）によるautophagic cell deathの機構の違いを解明する。
３.成果をまとめ、論文発表の準備をする。
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