ＲＡＮＫＬによる破骨細胞分化に関わる遺伝子Ｍｓｉ２の作用に関する研究

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24592256
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 門野 夕峰 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (70401065)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安井 哲郎 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (30583108) ; 大島 寧 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (50570016)
• Keywords: 破骨細胞 / 分化 / RANKL

Research Abstract

骨髄細胞をマウスから採取し、RANKL刺激を行うことによりMsi2の発現量及び局在の変化を解析した。破骨前駆細胞及びRANKL刺激後1-4日のmRNAとタンパクを抽出しReal-timePCRと免疫ブロッティングを行い、破骨細胞分化に伴いMsi2のｍRNA量とタンパク量が増加することを確認した。免疫染色では局在の変化を確認できた。破骨前駆細胞にレトロウイルスを用いてMsi2に対するshRNAの導入を行いMsi2をノックダウンし、分化が抑制されていることを確認した。Real-time PCRにおいて破骨細胞分化マーカーやNotch関連遺伝子について評価した。機能については対照群と有意差はなかった。破骨細胞分化においてMsi2が働いていると考えられた。
そのため、Msi2のノックアウトマウスを入手した。ノックアウトマウスから採取した骨髄細胞にRANKL刺激を行い、対照群と比較した。Real-time PCRにてMsi2の発現が抑制されていることと、Msi1が代償的な増加をしていないことを確認した。
現在、マイクロCTによる骨量の変化や形態計測を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成24年度はRANKLによる破骨細胞分化系におけるMsi2の動態の解析およびMsi2の強制発現及び抑制による破骨細胞分化への影響の解析を行う予定であった。これに関しては昨年の報告書にあるように、おおむね達成できたと考えられる。
平成25年度はMsi2のノックダウンが破骨細胞分化マーカーやNotch関連遺伝子、Numbに与える影響や、Msi1の関与について解析する予定であった。
これに関しては、Msi2のノックダウンでの破骨細胞分化マーカーやNotch関連遺伝子、NumbのReal-time PCRでの評価を行ったこと、Msi1についてはノックダウンではないが、ノックアウトマウスにて解析したことから、おおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

ノックアウトマウスを入手したので、それについて解析を行う予定である。
ノックアウトマウスから採取した骨髄細胞にRANKL刺激を行い破骨細胞に分化させる実験系において、mRNA,タンパクを採取し、Msi2や破骨細胞関連マーカーの評価を行う。TRAP染色やPit formation assay、survival assayも行い、破骨細胞分化や機能、生存の評価も行う。骨芽細胞の分化や骨芽細胞と破骨細胞の共存培養についても行う。
また、骨形態計測やマイクロCTでin vivoでの評価も行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

おおむね順調に進んだため次年度計画のために経費にする。
ノックアウトマウス解析にかかる試薬、機器等