2013 Fiscal Year Research-status Report
ＲＮＡｉを用いたアクアポリン機能調節による脳浮腫抑制のｉｎ ｖｉｖｏへの応用
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24592310
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
藤田 義人 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90238593)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅井 清文 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90264738)
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| Keywords | AQP4 / ノックダウン |
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| Research Abstract |
昨年に引き続きアクアポリン（AQP）Knockdown lentiviralの確立を重点に行った。
神経系の細胞のRNAiで定評のあるinvitrogen社製のBock-it Inducible H1 Lentiviral RNAi systemを利用した。まずKnockdownが確認されている2-3のconstructを作成したうえ、entry vectorであるpENTER/H1/TO Entry Constractに導入した。目的遺伝子をもつpENTER/H1/TO Entry Constract とpLenti4/BLOCK-IT/DESTをかけあわせることにより目的のshRNAを発現する遺伝子をもったpLenti4/BLOCK-IT/Expression Construct vectorを作成した。そのプラスミドを大腸菌にtransformationして、大量培養し、Quiagen社のキットを用いて、目的となるshRNAを発現する遺伝子をもったconstructを含むプラスミドを大量に、無菌的に精製した。
293FTセルラインでレンチウイルスを発現させるため、作成したpLenti4/BLOCK-IT/Expression Constructに加え、レンチウイルスの作成能力を高めるpLP1、pLP2、pLP/VSVG、pENTER-gusのプラスミドをcotransfectさせた。以上により目的となるAQP Knockdown のshRNAiを発現するレンチウイルスの作成を完了した。これらの操作により作成した、レンチウイルスを培養液に加えアストロサイトのAQP４の発現量を現在検討中である。発現は、テトラサイクリンで調節できるためその抗生剤による調節の有用性も検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RNAiを用いて、アストロサイトに強く発現し脳浮腫との関係が強く示唆されているAQP4をknockdownのcell lineを得るに至っていること。
AQP4発現量については、まだ十分であるといえず、現在条件設定などを検討中であること。
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| Strategy for Future Research Activity |
LentiウイルスでのRNAiの手法を用いてAQP4を knockdownしたアストロサイトのcell line を確立する。現在の段階では、目的のshRNAを発現する遺伝子をもったpLenti4/BLOCK-IT/Expression Construct vectorを大量に作成するには至ったが、発現量の調節などの完成には至っていない。それらを、完成させ、実験を円滑に進めるようなcell lineを完成する。また、AQP4 overexpression細胞株も作成する。AQP4 knockdownに正常のAQP4 cDNAの遺伝子導入し、rescue experimentsを行うことで、AQP4蛋白の役割を確認する。さらに、A
QP4 knockdownまたはoverexpression株に低酸素負荷を行い、AQP4の増減が低酸素付加による脳浮腫に与える影響を明らかにする。それらに加えて、低酸素負荷に対する低温による保護効果を確認し、さらに薬剤処置を行うことでの併用効果を検討し、AQP4の発現機能調節が脳浮腫の発生、治療への関わりを明らかにする。これらの実験結果を踏まえて、in vivoでの応用を模索する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
RNAiを用いて、アストロサイトに強く発現し脳浮腫との関係が強く示唆されているAQP4をknockdownのcell lineを得るに至っているが、AQP4発現量については、まだ十分であるといえず、現在条件設定などを検討中である。そのため、これらに関する試薬の予算を繰り越すこととした。
確立したcell lineでのAQP4発現量などの調節。Overexpression細胞株の確立。AQP4ノックダウンに対するrescue experimentでのAQP4蛋白の役割の確認。以上の計画で実験を遂行していきたい。そのための、実験器具、試薬、動物、培養液や実験の遂行で必要な記録の媒体やソフトなど必要な資材を購入する予定である。
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[Journal Article] A comparison between dosages and plasma concentrations of dexmedetomidine in clinically ill patients: a prospective, observational, cohort study in Japan2013
Author(s)
Yoshihito Fujita, Koichi Inoue, Tasuku Sakamoto, Saya Yoshizawa, Maiko Tomita, Yoshie Maeda, Hitomi Taka, Ai Muramatsu, Youichiro Hattori, Hiroyuki Hirate, Toshimasa Toyo’oka, Kazuya Sobue
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Journal Title
Journal of Intensive Care
Volume: 1
Pages: 15
DOI
Peer Reviewed
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