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2012 Fiscal Year Research-status Report

哺乳動物精子の卵活性化能に対する新しい評価法の確立

Research Project

Project/Area Number 24592441
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionChiba University

Principal Investigator

伊藤 千鶴  千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80347054)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 年森 清隆  千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20094097)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords精子 / 卵活性化能 / 核周囲物質 / 中心体関連タンパク質 / MN13 / ODF2 / equatorin
Research Abstract

精子の卵活性化能を評価するために、【1】初期卵活性化能 (受精卵の減数分裂の再開)と【2】後期卵活性化能(受精卵の微小管形成の促進)に分け、【3】ヒト精子の卵活性化能の評価のためのマウス実験系システムを構築することを最終目標とし、3年間の研究目的をたてた。平成24年度は、【目的1】に対しては、Equatorin-EGFP TGマウスおよび野生型マウスの精巣を用いて、精子形成におけるequatorinの発現および輸送過程を高解像顕微鏡、STED CW、透過型電子顕微鏡(免疫金コロイド法)を用いて解析した。その結果、equatorinが先体膜とその周囲の基質と複合体を形成していることが示唆されたため、これに相応した新しい名称 (COMAM, CIMAM, CAMM)を提唱し、論文に発表した。また、ヒト成熟精子と精巣におけるequatorinの発現をMN9抗体と新しく作製したEquatorin59-72番目のアミノ酸残基をエピトープとするhEQT抗体を用いて、ヒト先体マーカーとしての有効性を比較検討した。【目的2】に対しては、ODF2-2α-EGFP TGマウスのODF2-2α-EGFP遺伝子が導入された染色体を同定した。現在、同染色体上に導入遺伝子をもつ雄と雌を交配させて両アリルにODF2-2α-EGFPが導入されたマウスを作製中である。また、中心体に局在するODF2アイソタイプであるODF2-4に赤色蛍光タンパク質mCherryを繋ぎカルメジンプロモーターをつけたvectorを作製し、常法通りの方法で遺伝子改変マウスを作製中である。【目的3】に対しては、健常者および不妊患者の射出精子を用いて、抗equatorin抗体と抗MN13抗体がそれぞれ、ヒト精子マーカーとなること、また、これらの抗体を用いることによって患者精子の質の違いを個別に評価できることを示した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成24年度の研究実施計画【1-1】に対しては、作製したPLCζ-Venus TGマウスが発色しなかったため、現在、MN13の同定を進めている。【1-2】に対しては、EQT-EGFP TGマウスの精巣を用いて、精子形成におけるEQTの発現および輸送過程を解析し、その結果を日本顕微鏡学会第68回学術講演会およびCell and Tissue Research誌に発表した(Ito et al., 2013 in press. doi: 10.1007/s00441-013-1605-y)。【2】に対しては、ODF2-2α-EGFP TGマウスの遺伝子が導入された染色体を同定し、同染色体上に導入遺伝子をもつ雄と雌を交配させて両アリルにODF2-2α-EGFPが導入されたマウスを作製中である。また、ODF2-4に、赤色蛍光タンパク質mCherryを繋ぎカルメジンプロモーターをつけたvectorを作製し、B6系の前核期受精卵の男性前核に注入するマイクインジェクションによる遺伝子導入により、遺伝子改変マウスを作成中である。さらに、平成26年度の計画【3】の一部を前倒しで実施し、抗Equatorin抗体であるMN9抗体とhEQT抗体のヒト先体マーカーとしての有用性を新学術領域研究第2回国際シンポジウムおよび第118回日本解剖学会総会・全国学術集会で発表した。また、核周囲物質MN13を認識する抗MN13抗体を用いて患者精子の質の違いを個別に評価できることを第57回日本生殖医学会学術講演会・総会で発表した。

Strategy for Future Research Activity

概ね、平成25年度の研究実施計画に従って実験を推進する。【1-1】MN13の同定を引き続き行う。【1-2】1. EQT-EGFP-TG雄と野生型雌を交配させて得たin vivo受精卵/胚をtime-lapseで撮影してEQTの卵活性化への関連を解析する。2.胚発生における各段階で得られる試料を化学固定し、種々の特異抗体(抗精子抗体)や初期卵活性化に関わる抗MN13抗体や抗PLCζ抗体を用いて免疫組織化学的検索と電顕レベルの検索を行い、分子変化を解析する。【2】1. 引き続き、同染色体上にODF2-2α-EGFPが導入された雄と雌を交配させて両アリルにODF2-2α-EGFPが導入されたマウスを作製する。ODF2-4-mCherry TGマウスを作製し、戻し交配を行った後、遺伝子が導入された染色体を同定して、両アリルにODF2-4-mCherryが導入されたマウスを作製する。ODF2-4-mCherry TGマウスの精巣を解析し、ODF2-4とODF2-2αの発現パターンを比較する。ODF2 TG雄と野生型雌を交配させて得たin vivo受精卵/胚をtime-lapseで撮影してODF2の卵活性化との関連を解析する。2. ODF2のアイソタイプODF2-2α-EGFPにODF2-1α-mCherry、ODF2-3β-mCherry、ODF2-4-mCherryをそれぞれ繋いだvectorを現在作製中である。これらを培養細胞に導入し、中心体マーカーSP抗体 (作製済)で免疫染色し、各ODF2アイソタイプと中心体との関連を解析する。さらに、超顕微鏡を用いてそれぞれのアイソタイプの相互関係をナノレベルで解析する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

消耗品の購入、成果発表の旅費、人件費・謝金、論文投稿費に使用する。消耗品は、主にトランスジェニックマウス作製費用と遺伝子改変マウスの維持費と受精実験に使用するものである。具体的には、薬剤、培地、実験動物、培養細胞、培養ディッシュ、チップ・ガラス器具、ペプチド合成、プライマー合成、シークエンス、2次抗体等に使用する。また、成果発表のため、国内学会(日本顕微鏡学会-大阪、日本生殖医学会-神戸、分子生物学会-神戸、日本解剖学会-栃木)に参加する予定である。

  • Research Products

    (20 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (14 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Integration of the mouse sperm fertilization-related protein equatorin into the acrosome during spermatogenesis as revealed by super-resolution and immunoelectoron microscopy.2013

    • Author(s)
      Ito C, Yamatoya K, Yoshida K, Fujimura L, Hatano M, Miyado K, Toshimori K.
    • Journal Title

      Cell Tissue Res.

      Volume: In Press Pages: In Press

    • DOI

      10.1007/s00441-013-1650-y

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tysnd1 deficiency in mice interferes with the peroxisomal location of PTS2 enzymes, causing lipid metabolic abnormalities and male infertility.2013

    • Author(s)
      Mizuno Y,et al.
    • Journal Title

      PLoS genet.

      Volume: 9(2) Pages: e1003286

    • DOI

      10.1111/and.12030

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Galnt3 deficiency disrupts acrosome formation and leads to oligoasthenoteratozoospermia.2013

    • Author(s)
      Miyazaki T, Mori M, Yoshida CA, Ito C, Yamatoya K, Moriishi T, Kawai Y, Komori H, Kawane T, Izumi S, Toshimori K, Komori T.
    • Journal Title

      Histochem and Cell Biol.

      Volume: 139(2) Pages: 339-354

    • DOI

      10.1007/s00418-012-1031-3

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Unique structures of organelles observed in primary spermatocytes after micro-injection of protein solutions such as immunoglobulin into the lumen of the seminiferous tubules in mice and rats.2012

    • Author(s)
      Toyama Y, Chen C, Yamatoya K, Maekawa M, Ito C, Toshimori K.
    • Journal Title

      Andrologia.

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1371/journal.pgen.1003286

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 抗equatorin 抗体はヒト先体マーカーとして有効である2013

    • Author(s)
      伊藤千鶴、大和屋健二、陳城、前川眞見子、神村今日子、武藤透、年森清隆
    • Organizer
      第118回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • Place of Presentation
      サンポート高松・かがわ国際会議場
    • Year and Date
      20130328-20130330
  • [Presentation] EQT-EGFP transgenic mouse を用いた time laps imaging と微細構造の対比による先体膜タンパク質 equatorin の挙動解析2013

    • Author(s)
      年森清隆、伊藤千鶴、大和屋健二、陳城、前川眞見子
    • Organizer
      第118回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • Place of Presentation
      サンポート高松・かがわ国際会議場
    • Year and Date
      20130328-20130330
  • [Presentation] 精子先体赤道部は、先体反応の過程でIZUMO1 のflip-flop によるN末端の露出の後、脆くなる2013

    • Author(s)
      大和屋健二、伊藤千鶴、大澤光次郎、陳城、前川眞見子、岩間厚志、幡野雅彦、年森清隆
    • Organizer
      第118回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • Place of Presentation
      サンポート高松・かがわ国際会議場
    • Year and Date
      20130328-20130330
  • [Presentation] マウス精巣および精子における膜タンパク質ベイシジン分子の解析2013

    • Author(s)
      前川眞見子、大和屋健二、陳城、野崎正美、伊藤千鶴、年森清隆
    • Organizer
      第118回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • Place of Presentation
      サンポート高松・かがわ国際会議場
    • Year and Date
      20130328-20130330
  • [Presentation] The pathogenic mechanism of abnormal peroxisome lipid metabolism in Tysnd1 deficient mice.2012

    • Author(s)
      Mizuno Y, et al.
    • Organizer
      The 35th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan.
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • Year and Date
      20121211-20121214
  • [Presentation] Correlation between sperm head morphology and oocyte activation ability.2012

    • Author(s)
      Toshimori K, Ito C.
    • Organizer
      The 63rd Congress of Korean Society for Reproductive Medicine (KSRM) 2012.
    • Place of Presentation
      Seoul Women's University. Seoul
    • Year and Date
      20121201-20121201
    • Invited
  • [Presentation] Equatorin (EQT) as a human sperm acrosome biomarker for the fertilization process.2012

    • Author(s)
      Ito C, Yamatoya K, Toshimori K.
    • Organizer
      International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC)
    • Place of Presentation
      Hotel Nagoya Garden Palace
    • Year and Date
      20121112-20121116
  • [Presentation] Categorization of acrosome reaction and isolation of those sperm for biochemical analyses.2012

    • Author(s)
      Yamatoya K, Ito C, Osawa M, Chen C, Maekawa M, Iwama A, Hatano M, Toshimori K.
    • Organizer
      International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC).
    • Place of Presentation
      Hotel Nagoya Garden Palace
    • Year and Date
      20121112-20121116
  • [Presentation] Subcellular and molecular events during mouse acrosome reaction mediated by fertilization-related protein equatorin.2012

    • Author(s)
      Toshimori K, Yamatoya K, Ito C.
    • Organizer
      International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC).
    • Place of Presentation
      Hotel Nagoya Garden Palace
    • Year and Date
      20121112-20121116
  • [Presentation] 抗perinuclear theca MN13抗体を使った新しい精子評価法2012

    • Author(s)
      伊藤千鶴、大和屋健二、兼子 智、年森清隆
    • Organizer
      第57回日本生殖医学会総会・学術講演会
    • Place of Presentation
      長崎ブリックホール、長崎新聞文化ホール
    • Year and Date
      20121109-20121109
  • [Presentation] 先体反応過程における精子膜と先体膜タンパク質の変化2012

    • Author(s)
      大和屋健二、伊藤千鶴、年森清隆
    • Organizer
      第57回日本生殖医学会総会・学術講演会
    • Place of Presentation
      長崎ブリックホール、長崎新聞文化ホール
    • Year and Date
      20121108-20121108
  • [Presentation] 先体膜タンパク質Equatorin を指標したマウス先体形成の解析2012

    • Author(s)
      伊藤千鶴、大和屋健二、陳城、前川眞見子、年森清隆
    • Organizer
      日本顕微鏡学会 第68回学術講演会
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場
    • Year and Date
      20120514-20120514
  • [Presentation] 初期の先体反応における精子の形態とタンパク質の解析2012

    • Author(s)
      大和屋健二、伊藤千鶴、陳城、前川眞見子、年森清隆
    • Organizer
      日本顕微鏡学会 第68回学術講演会
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場
    • Year and Date
      20120514-20120514
  • [Presentation] マウス精巣および精子におけるベイシジン分子の解析2012

    • Author(s)
      前川眞見子、陳城、大和屋健二、伊藤千鶴、年森清隆
    • Organizer
      日本顕微鏡学会 第68回学術講演会
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場
    • Year and Date
      20120514-20120514
  • [Book] カラーイラストで学ぶ 集中講義 解剖学 生殖器2012

    • Author(s)
      年森清隆、伊藤千鶴
    • Total Pages
      483 (216-251)
    • Publisher
      メジカルビュー社
  • [Remarks] ホームページ 業績

    • URL

      http://www.m.chiba-u.ac.jp/class/devbiol/

URL: 

Published: 2014-07-24  

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