2014 Fiscal Year Research-status Report
子宮頸がんにおける早期診断マーカーとしての血清中ｍｉＲＮＡの探索と解析
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24592533
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
西 洋孝 東京医科大学, 医学部, 講師 (60307345)
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2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | microRNA / 子宮頸癌 / 腫瘍マーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
microRNA（miRNA）の発現パターンが、がんを含む種々の疾患で変化することが報告されており、診断・治療に関するバイオマーカーとしても有望視されている。本研究では、子宮頸癌の早期診断を可能とするような血清中miRNAの探索・同定を行うために、子宮頸癌患者における循環血液中のtotal RNAを抽出し、miRNAマイクロアレイを用いて網羅的に発現量の大きく変化しているmiRNA（miR-483-5p、miR-1246、miR-1275およびmiR-1290）を同定した。子宮頸癌47例、子宮頸部上皮内腫瘍（CIN）64例、健常者34例から循環血液中のtotal RNAを抽出し、realtime RT-PCR法にてこれらmiRNAが腫瘍マーカーとなり得るか定量解析した。また、子宮頸癌組織においてその発現が低下しているmiR-100についても調べた。これらと進行期や組織型などとの相関性を調べ、末梢循環miRNAの臨床的意義を探る。
これらmiRNAの候補標的遺伝子をin silico解析により検索したが、miR-100の候補標的遺伝子にパクリタキセル感受性遺伝子ubiquitin specific peptidase（USP）15を見出した。3’UTRを含むUSP15遺伝子配列をルシフェラーゼコンストラクトに組み込み、miR-100強制発現系でルシフェラーゼアッセイを行ったところ、ルシフェラーゼ活性が減弱した。また、子宮頸癌細胞株HeLaを通常酸素濃度と低酸素下（1％O2）に24時間培養し、miR-100とUSP15の発現をrealtime RT-PCR法やwestern blot法にて確認したところ、低酸素がmiR-100の発現を亢進しUSP15の発現を抑制することを見出した。miR-100強制発現系を用いて，HeLaに対するパクリタキセルの感受性の変化を増殖能をもって検討したが、miR-100強制発現系ではパクリタキセルに耐性を示した。
低酸素によりがんの悪性度が増強されることが知られているが、低酸素によるmiR-100の発現亢進がパクリタキセル耐性に寄与することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
検体採取の徹底がなされず、予定検体採取数に達していない。miR-100の標的遺伝子についての解析は進んでいるが、他のmiRNAのそれについては検討中にとどまっている。想定よりも多くの候補標的遺伝子があがったために、それらについての文献確認に時間をとられてしまったことが理由である。以上により、計画に比べやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き検体採取を行い、血清中miRNA発現量の測定を行う。また、miR-483-5p、miR-1246、miR-1275およびmiR-1290の候補標的遺伝子の文献的検討を行い、miR-100同様に機能解析を行っていく。血清中の各miRNAの発現量と臨床情報の相関性を解析し、子宮頸癌の腫瘍マーカーとしての意義を検討する。
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| Causes of Carryover |
無駄な実験を回避し、効率よくmiR-483-5p、miR-1246、miR-1275およびmiR-1290の候補評的遺伝子を探索するために、複数の解析ソフトを利用した。この絞り込み解析を行ったために、本来の解析実験に遅れが生じた。また、miR-100とその標的遺伝子USP15に関する論文作成においても、追加実験の必要性から遅れが生じており、英文添削費や投稿費の未使用額が発生する理由となっている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
RNAの抽出、PCRなどの遺伝子増幅、子宮頸癌細胞株への核酸の形質導入等の分子生物学的手法を用いた実験のための培養液や各種試薬の購入費に使用する。また、miR-100とその標的遺伝子USP15に関する成果を始め、各々の成果を報告する論文作成における英文添削費と投稿費にも使用する。
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