頭頸部扁平上皮癌における細胞接着阻害分子ポドカリキシンの発現、および機能の解析

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24592601
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 村上 大造 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (70398212)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ポドカリキシン / 頭頸部癌

Research Abstract

ポドカリキシンはシアロムチンファミリーに分類される細胞膜蛋白で、細胞接着阻害分子として機能し、本来緊密な接着構造を維持している上皮細胞において、あえてその接着を解除する機能を担うユニークな分子である。近年、前立腺癌、乳癌、大腸癌などの癌組織での高発現と疾患の予後不良との関係が報告されている。本研究では、国内外においていまだ解析がなされていない頭頸部扁平上皮癌において、ポドカリキシンの発現について臨床検体を用いて検索し、局所浸潤傾向、所属リンパ節、遠隔転移ならびに生存率との関連について解析し、頭頸部癌における予後不良因子となりうる蛋白であるかについて検討することを目的とする。また、頭頸部扁平上皮癌培養細胞への遺伝子導入により、浸潤能の変化を分子生物学的に解析することを目的としている。
H24年度は頭頸部扁平上皮癌摘出標本におけるポドカリキシンの発現検索をまず行った。
当科にて外科的治療で摘出した頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、一次抗体には抗ポドカリキシン抗体(K-19　SantaCruz)を用いて免疫組織学的に検討を行ったが、上記の組織においてはポドカリキシンの発現はほとんど認められなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画通りの研究を開始したが、仮説で予想していた頭頸部癌組織におけるポドカリキシンの発言が確認できていないため、研究が進展していない状況である。

Strategy for Future Research Activity

頭頸部癌組織でポドカリキシンの発現が確認できなかった前年度の結果については、①もともと頭頸部癌組織ではポドカリキシンが発現していない、②実験系の問題などの要因が考えられる。本年度はまず、前年度に使用した抗体以外の一次抗体を購入し実験を行い、発現確認を進めていく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

①頭頸部扁平上皮癌摘出標本におけるポドカリキシンの発現検索
平成20年～22年の３年間に当科にて外科的治療で摘出した頭頸部扁平上皮癌20例のホルマリン固定・パラフィン包埋組織の免疫組織染色によりポドカリキシンの発現を検討する。一次抗体には抗ポドカリキシン抗体を用い、ABC法により検出する。発現程度を陰性（細胞数の1%未満）、弱陽性（1%以上50%未満）、強陽性（50%以上）に分類し、頭頸部扁平上皮癌での発現頻度を確認する。（研究代表者が施行）
②ポドカリキシン発現プラスミド作成
ポドカリキシンの発現が確認されている正常糸球体培養細胞（ポドサイト　ATCCより購入）よりmRNAを抽出し逆転写によりcDNAライブラリーを作成する。その後、PCRにてポドカリキシン遺伝子を抽出し、pcDNA3プラスミドに挿入する(pcDNA3-podocalyxin)。DNAシーケンスにより遺伝子配列を、また、COS7細胞へのリポフェクション法による遺伝子導入後、細胞抽出液のウエスタンブロット法により蛋白発現を確認する。（連携研究者　蓑田涼生が施行）