2012 Fiscal Year Research-status Report
軟骨細胞及び軟骨膜細胞を利用した気管軟骨の再生に関する研究
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24592604
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
野本 幸男 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70508811)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 気管 / 再生 / 組織工学 |
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| Research Abstract |
軟骨細胞・軟骨膜細胞を有する培養気管の作製を行った。
〔軟骨細胞、軟骨膜細胞の採取〕全身麻酔下に、ウサギ（本白色系ウサギ♂）の肋軟骨を採取した。採取の際には胸壁損傷に伴う気胸を起こさないよう注意して操作した。採取した肋軟骨を軟骨組織と軟骨膜組織に分断し、それぞれ小さな組織片に細分した。軟骨細胞は、軟骨組織片をコラゲナーゼ処理し浮遊する細胞を濾過することで採取可能であった。軟骨膜細胞は10％FBS含有D-MEM用いて組織片培養を行うことで採可能であった取した細胞の継代培養を行う。得られた細胞を継代培養し、必要な細胞数を確保できた。
〔培養気管の作製〕I型コラーゲン溶液に再構成用緩衝液及び培養された軟骨細胞あるいは軟骨膜細胞を混合し細胞含有コラーゲン溶液を作製した。コラーゲン溶液は37℃でゲル化するものを用いた。ウサギの気管再建目的に作製した自己組織再生型人工気管に細胞含有コラーゲン溶液を浸透させゲル化させ、培養気管を作製でした。
〔標本作製・評価〕。作製した培養気管をパラフィン包埋し、組織切片を作製した。H-E染色での観察では、人工材料のコラーゲン線維の間隙に付加した細胞がほぼ均一に散在していることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
軟骨細胞、軟骨膜細胞の採取〕ウサギの肋軟骨の採取から、軟骨細胞、軟骨膜細胞の採取、さらに細胞培養に至る方法の確立は、最終的に必要細胞数が確保できたことから、おおむね達成できたと考えられた。
〔培養気管の作製、標本の作製・評価〕培養軟骨細胞あるいは軟骨膜細胞を人工材料に導入する方法は、ゲル化するI型コラーゲン溶液を用いた細胞懸濁液として人工材料に導入することで、人工材料内に均一に細胞を播種できることが確認できたことから、おおむね達成できたと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivoで、ウサギの気管欠損部への培養気管の移植実験を中心に行う。前年度の研究も継続して行う。
〔細胞の蛍光標識〕移植細胞を宿主細胞と区別・同定できるように、遺伝子導入技術を用いて、培養軟骨細胞と培養線維芽細胞に蛍光蛋白（GFP、YFP等）などの遺伝子を導入試みる。
〔培養気管の作製〕標識された培養軟骨細胞、軟骨膜細胞を用いて平成24年度と同様に培養気管モデルを作製する。
〔気管再建〕培養気管が気管欠損部を覆うよう留置し縫合糸で気管と縫合する。
〔標本採取、標本作製・評価〕観察期間の後に気管を摘出する。摘出した気管の凍結切片、パラフィン切片、あるいはTEM用の標本を作製する。H-E染色やトルイジンブルー染色等での形態観察を行う。蛍光顕微鏡にて蛍光標識した細胞を経時的に評価する。免疫染色（type II collagen等）、TEMにて軟骨組織の構造、再生気管の層構造を評価する。質的評価としてはRT-PCR(type II collagen、aggrecan)などを行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品（実験動物、実験器具、試薬等）： 800,000円
旅費 ： 300,000円
その他（学会参加費など）： 100,000円
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