2012 Fiscal Year Research-status Report
自己免疫網膜症患者血清が認識する網膜特異抗原の網羅的解析と発症機構に関する研究
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24592667
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
菊池 孝信 信州大学, ヒト環境科学研究支援センター, 教授 (50177797)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 浩一 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70262730)
宮原 照良 信州大学, 医学部附属病院, 助教 (80362135)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 癌関連網膜症 / 自己免疫 / プロテオーム解析 |
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| Research Abstract |
本研究計画の目的は、自己免疫網膜症患者血清が認識する網膜特異抗原タンパク質をプロテオーム解析法により網羅的に同定し、その発症機構を分子レベルで解明することにある。
（１）患者血清が認識する網膜特異抗原の網羅的プロテオーム解析を行った。マウス網膜より抽出したタンパク質を２次元電気泳動し、ウエスタンブロット法により患者血清が認識する網膜特異抗原タンパクの検索を行い、陽性スポットのゲルを切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行った。抽出したペプチドはLC-MSによりアミノ酸配列を同定した。
（２）ヒト抗原遺伝子のcDNAクローニングと大腸菌発現組換えタンパク質による抗原タンパクの同定を行った。プロテオーム解析により推定された抗原タンパク質について、ヒト網膜由来のRNAから調整されたMarathon-Ready cDNA（クロンテック社）を用いて抗原タンパクの全翻訳領域を含むcDNA断片をPCR法により増幅し、大腸菌発現ベクターに挿入し、ヒト由来の網膜特異抗原タンパクを大腸菌に産生させた。この組換えタンパクをHis-Tagアフィニティカラムを用いて精製し、ウエスタンブロットの試料とした。現在までに、既知の抗原タンパクを含め７個の抗原タンパク質をクローニングした。４２例の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。９例の患者血清が新規の抗原タンパク質を共通して認識することが明となった。この抗原タンパク質について、さらに詳細な検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
７個の網膜抗原タンパクをクローニングすることが出来、ほぼ順調に研究を進めることができた。しかし、当初予定していた動物実験による網膜障害性の検討までは至っていないのが現状である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに５０例以上の患者血清についてウエスタンブロット法、免疫染色法およびOCTによる検討を行って来た。そのなかで、錐体細胞、色素上皮細胞、ミューラー細胞特異的抗原を認識する血清を見いだしている。このような抗原タンパク質の同定は未だ成されていない。プロテオーム解析により特異的な抗原タンパク質の同定を進める。また、新たに同定された抗原タンパクについて、動物実験等を用いて網膜障害性の検討を行い、発症機構の分子解析を行う。
（１）患者血清が認識する網膜特異抗原の網羅的プロテオーム解析
平成２４年度と同様の手法を用いて、複数の患者血清について抗原タンパクの検索・同定を行う。
（２）精製した組換え抗原タンパクをマウスに免疫して網膜・視機能への影響を検討する。
８週齢のマウスに精製した組換え抗原タンパクを２週間の間隔で３回免疫する。コントロールとして抗原タンパクの代わりに牛血清アルブミン（BSA）を同様に免疫する。最後の免疫から１週間後にマウスの尾静脈より0.1ml程度血液を採取し、血清を調整する。ELISA 法を用いて血清中に抗原タンパクに対する抗体価の上昇を確認する。免疫してから経時的に網膜電位を測定して視機能への影響の有無を検討する。視機能への影響が見られた場合は眼球を摘出し、組織形態学的検討を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
購入物品の納品日が、次年度となったため、次年度使用額（26,396円）が生じた。平成２５年度では前年度と同様にプロテオーム解析による網膜特異抗原の同定を行うとともに動物実験を開始するため、研究費の大半は実験動物（マウス）の購入・飼育管理費と抗体を含む試薬等に使用する予定である。
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[Journal Article] Severe atopic dermatitis accompanied by autoimmune retinopathy.2013
Author(s)
Nomura T, Kayama T, Okamura E, Ogino K, Uji A, Yoshimura N, Kikuchi T, Fujisawa A, Tanioka M, Miyachi Y, Kabashima K.
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Journal Title
Eur J Dermatol
Volume: 23
Pages: 263-264
DOI
Peer Reviewed
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