2014 Fiscal Year Research-status Report

２本の血管柄付き末梢神経移植による網膜－視覚中枢投射の再構築

Research Project

Project/Area Number	24592714
Research Institution	International University of Health and Welfare
Principal Investigator	小阪淳国際医療福祉大学, 保健医療学部, 教授 (40243216)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木股敬裕岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50392345) 若林毅俊関西医科大学, 医学部, その他 (90302421)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2016-03-31
Keywords	マイクロサージェリー / 髄鞘 / 網膜神経節細胞 / 視神経
Outline of Annual Research Achievements	遺伝子改変マウスにおける視神経再生実験は、多くの研究グループから報告されている。一方で、私のグループは、ラットを使って末梢神経移植による視神経再生に取り組んでいる。双方とも、再生した視神経の同定方法に問題をはらんでおり、弱点のない統一的な手法の確立が急がれている。昨年度に引き続き、マイクロサージェリーの技術を用いた末梢神経移植の成否を評価し、再生視神経を持つ網膜神経節細胞を同定する方法について検証した。これまで、逆行性標識法としてGranular BlueやDiI等の蛍光色素を移植片にラベルし、網膜の伸展標本上で蛍光色素を持つ細胞を、「再生視神経軸索を持つ網膜神経節細胞」として同定してきた。マウスで一般的に用いられている、順行性標識による視神経標本における再生視神経数の同定法よりも、①再生視神経軸索内における不均一走行の欠点を排除できること、②網膜標本上で、再生視神経を持つ細胞の分布を同定できること、の2点で特に優れていることが明らかになった。逆行性標識法の欠点である、細胞死をきたした細胞の自家蛍光の誤認は、蛍光陽性細胞の形態、すなわち局在する網膜層の高さや細胞体の大きさ・形を一個一個丹念に観察し、網膜神経節細胞であることを確認することで解決できた。加えて蛍光色素に特異的な励起フルターでの観察に加えて、別フィルターでの観察で自家蛍光陽性細胞を除外することで、充分にこの問題を解決できることが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 血管柄付き末梢神経移植による網膜－視覚中枢投射様態の評価として、Eph-A、ephrin-Aの特異抗体による免疫染色、in situハイブリダイゼーションによるmRNAの同定、2種類以上の蛍光色素による順行性標識を組み合わせて取り組んできた。しかし、上記複数の手法を組み合わせて一枚の標本上で行う実験については、やや難航している。そのため、現時点で、満足できる実験データが得られていない。当初の目的を達成するために、研究期間の延長を申請した。
Strategy for Future Research Activity	1本の血管柄付き末梢神経移植法については、ほぼ完成をみたので、現在英文論文を執筆中である。視覚中枢部の投射視神経の分布と、分子の局在については、truncated trkB抗体、Eph-A, -B, ephrin-A, -Bについて、複数メーカーの抗体を入手し、その染色像を比較してゆく。また、網膜側の評価として、網膜神経節細胞に対する特異抗体C38と、Brn-3bの染色を行う。
Causes of Carryover	昨年度に、血管柄付き末梢神経移植による網膜－視覚中枢投射様態の評価の一部として、網膜標本に対してtruncated trkB抗体による免疫染色を行ったが、市販品の抗体の品質・力価が安定せず、移植手術の効果を多角的に評価する計画の一部見直しが必要になった。加えて、データ取得用のCCDカメラ制御用PCに不調が生じた。計画遂行にやむを得ず遅れが生じたので、未使用額を一部残して、補助事業の期間延長を申請し、次年度の未使用額を残した。
Expenditure Plan for Carryover Budget	truncated trkB抗体による免疫染色は、抗体の品質が安定するまで、一時延期することとし、他の手法による評価法を検討する。特に3種類以上の蛍光色素と、Brn-3b抗体による網膜側の免疫染色も考慮する。データ取得用PCについては新品を調達し、既に交換・調整を行ったので、データ取得・解析に、問題は生じないと考えられる。