皮膚創傷治癒における血管内皮間葉転換の関与を直接証明する

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24592718
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 菅原 康志 自治医科大学, 医学部, 教授 (60260494)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須永 中 自治医科大学, 医学部, 助教 (00406117)
• Keywords: 創傷治癒 / 血管内皮間葉移行 / 遺伝子改変マウス / 細胞運命追跡

Research Abstract

Tie2CreマウスとAi14（ROSA26-loxed-stop-tdTomato）マウスを交配させることにより、血管内皮由来細胞が赤色に蛍光発色するTie2Cre;Ai14マウスを作製した。Tie2Cre;Ai14マウスの皮膚組織を血管内皮細胞のマーカーであるCD31にて蛍光染色すると、CD31陽性細胞とtdTomato陽性細胞は完全に一致していた。
次に、Tie2Cre;Ai14マウスの背部に切開縫合創を作製し、術後2週における創部組織の免疫蛍光染色を行った。その結果、正常皮膚と同様に切開縫合創におけるtdTomato陽性細胞は全てCD31陽性であり、血管内皮間葉移行を確認することは出来なかった。
続いて、Tie2Cre;Ai14マウスの廃部に作製した切開縫合創に対して、延長器による牽引を加えることにより、切開牽引創を作製した。そして、術後2週における切開牽引創組織の免疫蛍光染色を行った。するとCD31陽性tdTomato陽性細胞の他に、CD31陰性tdTomato陽性細胞を確認することができ、血管内皮間葉移行の関与を示唆する所見を得ることができた。続いてこのCD31陰性tdTomato陽性細胞が、線維化に寄与していることを確認するために、Tie2Cre;Ai14マウスとCOL/EGFPマウスを交配して、血管内皮由来細胞が赤色に、コラーゲン１産生細胞が緑色に、それぞれ蛍光発色するマウスを作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

トリプルトランスジェニックマウス（Tie2Cre;Ai14;COL/EGFPマウス）作製の過程において、Tie2CreによるROSA26-loxed-stop-tdTomatoのrecombinationがメスのgerm lineに混入してしまい、Ai14遺伝子を保持するマウスのほとんどが、全身にtdTomatoを発現する状態となってしまった。そのため、疑わしいマウスを全て屠殺しなければならなくなり、混入の可能性がない少量のコロニーから、実験系を再構築したため、計画の遅延を生じた。

Strategy for Future Research Activity

Tie2Cre;Ai14マウスとTie2Cre;Ai14;COL/EGFPマウスにおける各種創傷組織を免疫蛍光染色することにより、血管内皮間葉移行の関与を確定させる。Tie2Cre;Ai14マウスとTie2Cre;Ai14;COL/EGFPマウスより抽出した細胞を用いて、培養系において血管内皮間葉移行の解析を行う。