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2012 Fiscal Year Research-status Report

骨代謝制御における未知の分子基盤を解き明かす新規分子の機能解明

Research Project

Project/Area Number 24592804
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionKyushu University

Principal Investigator

松田 美穂  九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (40291520)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords骨代謝 / 骨芽細胞 / 破骨細胞
Research Abstract

骨代謝制御における新規分子PRIPの機能解析を通して未知の分子基盤を明らかにすることを目的として、今年度は「PRIPの有無が及ぼす個体への影響」と「PRIPの有無が及ぼす骨芽細胞、破骨細胞分化への影響」について解析を行った。
野生型及びPRIPノックアウト(PRIP-KO)マウスにおいて、血中の骨代謝マーカーや関連ホルモン(アルカリホスファターゼ(ALP)、TRAP-b、オステオカルシン、オステオポンチンなど)の分泌量をELISA法で、またそれらの発現量をリアルタイムPCRで検討した。その結果は、これまでの解析結果(PRIP-KOマウスにおける海面骨の骨量、骨密度の増加、分化した骨芽細胞、破骨細胞の細胞数の増加、骨吸収活性の低下など)と相関していた。
野生型、PRIP-KOマウスの頭蓋骨から調製した骨芽細胞前駆細胞を用いて、骨芽細胞分化に重要なBMPシグナリングについて、ALP活性やSmad、ERK等のシグナル分子の発現量やリン酸化程度などを経時的に追った。BMP刺激に応じたSmad分子のリン酸化上昇後、野生型由来の骨芽細胞では低下するのに対しKO由来ではそのリン酸化状態が持続した。また、大腿骨由来の骨髄細胞を用いて破骨細胞分化におけるPRIP有無の影響を検討した。RANKL刺激による分化誘導過程において、RANKL、M-CSFの受容体であるRANK及びCD115の発現がKO由来の細胞において減少しており、分化誘導後のTRAP染色ではTRAP活性を持った破骨細胞数がKO由来の細胞で少ない傾向にあることが分かった。これらの結果から事前の解析結果をふまえ、PRIP分子の欠損により、骨芽細胞分化が促進され、破骨細胞分化が抑制されることが分子レベルで示された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PRIP-KOマウスの表現型から類推した可能性について、今年度は分子レベルでの解析を行ったが、これまでのPRIP分子に関する研究の蓄積もあり、研究を進めるにあたり想定外の大きなずれが生じなかった。また、マウスの頭骸骨や骨髄から採取した細胞を用いた初代培養を行っているが、前骨芽細胞の初代培養細胞についてはPRIP-KOマウスが生まれにくいため生まれたときに可能な限りストックを作っておくことで対応し、前破骨細胞の初代培養細胞についてはストックが出来ないが今年度は野生型とPRIP-KOマウスの適切な週令のものを得ることが比較的順調であった。これらのことからおおよそ計画通り遂行することが出来た。

Strategy for Future Research Activity

1.PRIPの有無が及ぼす骨芽細胞、破骨細胞分化への影響とそのメカニズム
・ 骨芽細胞および破骨細胞において受容体などの膜分子(BMP受容体、RANK/RANKL等)の発現量や局在をligand
binding assayやFACS、免疫染色等で検討する。また、これらの細胞から分泌される特徴的な分子(RANKL、サ イトカイン等)の分泌量をELISAで測定する。細胞に刺激を与え、分泌速度の変化を計時的に追い、PRIPの有無 の影響をみる。影響がある場合、膜発現や開口分泌に関わる種々の分子とPRIPとの相互作用や分泌に至る過程の どこにPRIPが関わるかを生化学的手法にて解析する。
2.細胞への変異体導入による解析
・ PRIP遺伝子についてRNA干渉用のコンストラクトを作製し、PRIPの発現を抑制した骨芽細胞に分化可能な培養 細胞の変異株(ノックダウン細胞)を構築する。 構築したPRIPノックダウン細胞において、骨芽細胞への分化 能を確認し、Smadなど骨芽細胞への分化と機能に重要でかつPRIPの有無が影響する分子の変異体を遺伝子導入し 、PRIPの機能の詳細を検討する。
・ 骨芽前駆細胞と破骨細胞前駆細胞の共存培養を行い、野生型およびPRIP-KOマウスそれぞれにおける骨芽細胞 の破骨細胞分化誘導へのポテンシャルや破骨細胞前駆細胞の分化能を生化学的手法にて検討する。カップリング に関わる分子群の発現や分泌にも着目して検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

・設備備品費:本研究において使用する機器・設備は、研究室所有或いは共有の備品として現有しているの で経費はかからない。
・ 消耗品費:薬品類、培養用血清等の消耗品費に大部分の費用を割く。
(培養細胞用培地 500円x10本、血清30,000円x1-2本、各種ホルモンアッセ イキット100,000円x4~6,市販の抗体 50,000円x3~5 他)
・ 旅費:関連分野の国内外での学会参加および成果発表のための旅費を計上する。
・ その他: 論文校閲費や資料送付費、動物飼育委託費は、従前の支出実績に基づいて計上する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Osteocalcin Induces Release of Glucagon-Like Peptide-1 and Thereby Stimulates Insulin Secretion in Mice2013

    • Author(s)
      Akiko Mizokami, Yu Yasutake, Jing Gao, Miho Matsuda, Ichiro Takahashi, Hiroshi Takeuchi, Masato Hirata
    • Journal Title

      PLoSONE

      Volume: 8 Pages: e57375

    • DOI

      10.1371

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Phospholipase C-related catalytically inactive protein, a novel microtubule-associated protein 1 light chain 3-binding protein, negatively regulates autophagosome formation2013

    • Author(s)
      Hisanori Umebayashi, Akiko Mizokami, Miho Matsuda, Kae Harada, Hiroshi Takeuchi, Isei Tanida, Masato Hirata, Takashi Kanematsu
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 432 Pages: 268-274

    • DOI

      10.1016

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Endogenous Cardiac Troponin T Modulates Ca2+-Mediated Smooth Muscle Contraction2012

    • Author(s)
      Kajioka S., Takahashi-Yanaga F., Shahab N., Onimaru M., Matsuda M., Takahashi R., Asano H., Morita H., Morimoto S., Yonemitsu Y., Seki N., Sasaguri T., Hirata M., Nakayama S. and Naito S.
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 2 Pages: 979

    • DOI

      10.1038/srep00979

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] PRIP欠損マウスが呈する生殖異常2013

    • Author(s)
      松田美穂、平田雅人
    • Organizer
      第11回口腔医科学フロンティア学術集会
    • Place of Presentation
      宮崎
    • Year and Date
      20130302-20130302
  • [Presentation] 生殖機構に欠かせない卵巣の機能における新規分子PRIPの役割2012

    • Author(s)
      松田美穂、平田雅人
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] PRIPの骨代謝制御における機能解析2012

    • Author(s)
      小谷美穂、松田美穂、平田雅人
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] PRIP-KO mice exhibit the decreased tooth movement by orthodontic force2012

    • Author(s)
      松田美穂、村上絢子、平田雅人
    • Organizer
      第35回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121211-20121214
  • [Presentation] Involvement of a novel signaling molecule, PRIP in the regulation of reproduction system2012

    • Author(s)
      Matsuda M., Kotani M., and Hirata M.
    • Organizer
      The 22th IUBMB, 37st FEBS Congress
    • Place of Presentation
      Sevilla, Spain
    • Year and Date
      20120904-20120909
  • [Presentation] Role of a novel protein in alveolar bone remodeling mechanism of tooth movement2012

    • Author(s)
      Murakami A., Matsuda M., and Hirata M.
    • Organizer
      The 22th IUBMB, 37st FEBS Congress
    • Place of Presentation
      Sevilla, Spain
    • Year and Date
      20120904-20120909
  • [Presentation] 骨芽細胞分化におけるPRIPの機能解析2012

    • Author(s)
      小谷美穂、松田美穂、平田雅人
    • Organizer
      日本生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20120526-20120527
  • [Remarks] 九州大学 大学院歯学研究院 口腔細胞工学

    • URL

      http://www.mcb.dent.kyushu-u.ac.jp/index.html

URL: 

Published: 2014-07-24  

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