2012 Fiscal Year Research-status Report
ステロイドによって誘導される膜タンパク質の細胞生物学的解析
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24592808
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
岡元 邦彰 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10311846)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30264055)
西下 一久 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (20237697)
坂井 詠子 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10176612)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ステロイド / エンドソーム・リソソーム |
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| Research Abstract |
dexamethason-induced transcript（以下Dexiと略す）の一次構造からGateway Systemを用いて融合タンパク質作成した。まず、マウスDexiのcDNAをAmerican Type Culture Collection (ATCC)より購入し、これをテンプレートとしてＰＣＲでDexiの遺伝子を増幅した。この際、目的の遺伝子発現に必要なコザック配列とクローニングベクターに挿入する際必要なCACCという配列をフォワードプライマーの５‘末端に付加しておいた。増幅に用いるDNAポリメラーゼには両端が平滑末端となるようPrime STARを用いた。これをTOPOベクター(pENTRTM/D-TOPO)へ挿入した。トポイソメラーゼの働きで、方向性をもったエントリークローンが作製できた。シークエンサーによって塩基配列を確認した後、発現クローンの作製を行った。発現ベクターはpcDNA-DEST47を用いた。これはDexiのC末端側にGFPが融合するよう設計されたベクターである。エントリークローンでは目的の遺伝子の両端にattL1とattL2という配列が、発現ベクターにはattB1とattB2という配列が設計されており、この領域で組換えが起こることで、目的遺伝子が発現ベクターに挿入された。塩基配列を確認した後、この発現ベクターをHeLa細胞とMC3T3-E1細胞にトランスフェクションした。G418により、HeLa細胞ではクローンを得ることができたが、MC3T3-E1細胞ではクローンを得られなかった。とりあえず、HeLa細胞でウエスタンブロット解析と蛍光抗体方により細胞内局在を調べたが、発現量が少ないようで、はっきりとした結果を得ることができなかった。現在、タグをGFPからFLAGに変更して、解析を進めている。発現ベクターの構築までは終わっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今回Gateway Systemを用いてDexi遺伝子とGFPの融合タンパク質作成し、細胞への発現を試みたが、発現量が少なく、局在等はっきりとした情報を得ることができなかった。一つには、Dexiタンパク質がGFPと比較して小さいことが関係し、正常な三次構造をとることができなかったのかもしれない。あと一つは、Dexiタンパク質に細胞特異性があるのかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
DexiとGFPとの関係については、GFPがDexiの３倍以上の分子量のため、適切な三次構造をとれなかった可能性がある。そこで、現在小さなタグのFLAGを用い、発現ベクターを作成し、すでに細胞へのトランスフェクションを開始している。また、Dexiタンパク質の発現に、細胞特異性がある可能性については、HeLa細胞、MC3T3-E1細胞以外の細胞を模索している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
試薬では、大腸菌用培地、RT-PCR、培地(DMEM, αMEM)、プライマーや抗体（FLAG抗体等）、牛血清、等がその大部分を占め、約30万円を超えると思われる。プラスティック類ではピペット、培養ディッシュ、遠心チューブが主なもので、約20万円。ガラス類は、ガラスピペット等で約10万円。その他、炭酸ガス等も必要で、約60万円くらいを予定している。
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