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2012 Fiscal Year Research-status Report

唾液腺腺房細胞の開口分泌に関わる分子の発現と動態解析

Research Project

Project/Area Number 24592820
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionThe Nippon Dental University

Principal Investigator

今井 あかね  日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (60180080)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 梨田 智子  日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (10133464)
吉江 紀夫  日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (30095278)
辻村 麻衣子(羽下麻衣子)  日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 講師 (60535219)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords耳下腺 / 腺房細胞 / エクソサイトーシス / Rabタンパク質 / GEF / GAP / SNARE / exocyst
Research Abstract

超高齢社会を迎え、唾液分泌量の低下による口腔乾燥症を訴える患者が増加している。咀嚼、嚥下、会話、齲蝕予防、感染予防など、QOL(クオリティー・オブ・ライフ)を考えるでは唾液タンパク質分泌は重要な要素である。本研究では、腺房細胞(外分泌細胞)における分泌顆粒の形成から放出後まで、細胞内膜輸送の必須因子である低分子量GTPase(Rab)を中心としたネットワークおよび開口分泌時の分子の動態を解明することを目的とした。
平成24年度は腺房細胞中のRab27の完全なGDP/GTPサイクルを明らかにした。すなわち、Rab27のGTP/GDP交換因子(Rab27-GEF)について調べた。Rab27-GEF活性を持つことがメラノサイトで知られているMADD/DENN/Rab3GEPのタンパク質発現と局在とをWestern Blot法により調べ、耳下腺腺房細胞の可溶性画分に認めた。次に抗MADDウサギ抗体を調製して、ストレプトリジンO(SLO)処理した腺房細胞に導入し、IPR刺激すると抗体濃度依存的にアミラーゼ分泌が阻害された。また、選択的にGTP型Rab27に結合するGST-SHDを用いたGTP-Rab27 pull-down assayでは、抗MADD抗体によりIPR刺激時のGDP/GTP交換反応が抑制されGTP型Rab27の量が有意に減少する結果を得た。さらに、GST融合MADDリコンビナントタンパク質(dominant negative type)を作成し、SLO処理細胞に導入した場合も、同様に濃度依存的にアミラーゼ分泌が阻害された。以上の結果から, Rab3GEPとして知られるMADDは耳下腺腺房細胞においてRab27-GEFとして働き、IPR刺激によるアミラーゼ分泌にRab27のGDP/GTP交換反応を通して関与していることが示された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

耳下腺腺房細胞のエクソサイトーシスにRab27が重要な役割を果たしている。しかし耳下腺腺房細胞内での挙動は明らかにされておらず、どのようなエフェクターが関与してRab27を制御しているのかも不明であった。現在までに耳下腺Rab27のGAP(GTPase活性化因子)はEPI64であること、GEF(GDP/GTP交換因子)はDENNDファミリーのMADDであることを突き止めた。本研究により、これまで明らかにしてきたRab27のエフェクターであるSlac2-c, Slp4, Noc2およびGDIと共にRab27の耳下腺腺房細胞でのおおよそ一連の挙動を推測できる段階にまで達することができた。

Strategy for Future Research Activity

(1)IPR刺激による耳下腺腺房細胞中の各種Rabとエフェクター類のmRNA発現変化の網羅的解析および各発現量の定量化―――マイクロアレイによる解析。発現量に変化のあるRabおよびエフェクターを選別し、リアルタイムPCR により定量化。
(2)経時的な各種Rabとエフェクターの細胞内局在変化の解析―――免疫組織化学的手法を用いてβ刺激前後のRabとRab/エフェクター複合体の挙動を観察する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成25年度の研究計画を継続して行い、更に(3),(4)および(5)の実験を開始する。
(3)経時的なRabのGTP型、GDP型の割合変化の検索―――GTPまたはGDP結合Rabを特異的に結合できる解析ツールを用いpull down assayによりGTP型とGDP型Rabの割合を算出する。(4)唾液腺腺房細胞内に発現しているRab27以外のRabをサイクルさせるための因子、GDP/GTP交換反応促進因子(GEF)、GTPase活性化タンパク質(GAP)、GDP/GTP交換反応抑制タンパク質(GDI)、GDP解離促進因子(GDF)の同定―――RT-PCR, ウエスタンブロッティング,免疫組織化学を駆使して、腺房細胞内発現と局在、刺激後の挙動を明らかにする。(5)分泌顆粒消失後から再生までのRabとエフェクターの挙動追跡―――β刺激により分泌顆粒を全て放出させ、そこから顆粒再生までをウエスタンブロッティング,免疫組織化学を駆使してRabとエフェクター挙動を経時的に観察する。

  • Research Products

    (9 results)

All 2013 2012

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (7 results)

  • [Journal Article] Antigen-presenting cells in parotid glands contain cystatin D originating from acinar cells.2013

    • Author(s)
      Nashida T, Sato R, Haga-Tsujimura M, Yoshie S, Yoshimura K, Imai A, Shimomura H.
    • Journal Title

      Arch Biochem Biophys

      Volume: 530 Pages: 32-39

    • DOI

      doi: 10.1016/j.abb.2012.12.009.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Exocyst subunits are involved isoproterenol-induced amylase release from rat parotid acinar cells.2012

    • Author(s)
      Imai A, Yoshie S, Haga-Tsujimura M, Nshida T, Shimomura H.
    • Journal Title

      Eur Oral Sci

      Volume: 120 Pages: 123-131

    • DOI

      doi: 10.1111/j.1600-0722.2012.00952.x.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Role of Rab27-GEF in Parotid Acinar Cell Exocytosis.2013

    • Author(s)
      Imai A, Ishida M, Fukuda M, Nashida T, Shimomura H.
    • Organizer
      91th General Session & Exhibition of the IADR
    • Place of Presentation
      アメリカ、シアトル
    • Year and Date
      20130320-20130323
  • [Presentation] Identification and Characterization of CSP in Parotid Acinar Cells.2013

    • Author(s)
      Shimomura H, Imai A, Nashida T.
    • Organizer
      91th General Session & Exhibition of the IADR
    • Place of Presentation
      アメリカ、シアトル
    • Year and Date
      20130320-20130323
  • [Presentation] DENN/MADD/Rab3GEPは耳下腺腺房細胞においてRab27のGDP/GTP交換因子(GEF)として機能する2012

    • Author(s)
      今井 あかね,石田森衛, 福田光則,梨田 智子,下村 浩巳
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 耳下腺腺房細胞の開口分泌におけるRab27のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の関与2012

    • Author(s)
      今井あかね、梨田智子、下村浩巳
    • Organizer
      第54回歯科基礎医学会学術大会
    • Place of Presentation
      福島県、郡山
    • Year and Date
      20120914-20120916
  • [Presentation] マウス耳下腺筋上皮細胞における骨格筋アクチンの発現2012

    • Author(s)
      梨田智子、吉江紀夫、羽下-辻村 麻衣子、今井あかね、下村浩巳
    • Organizer
      第54回歯科基礎医学会学術大会
    • Place of Presentation
      福島県、郡山
    • Year and Date
      20120914-20120916
  • [Presentation] Role of Exocyst subunits in parotid acinar cells.2012

    • Author(s)
      Imai A, Yoshie S, Haga-Tsujimura M, Nashida T, Shimomura H.
    • Organizer
      90th General Session & Exhibition of the IADR
    • Place of Presentation
      ブラジル、イグアスフォールズ
    • Year and Date
      20120620-20120623
  • [Presentation] lincRNAs in parotid acinar cells of Non-obese Diabetic Mouse.2012

    • Author(s)
      Nashida T, Imai A, Shimomura H.
    • Organizer
      90th General Session & Exhibition of the IADR
    • Place of Presentation
      ブラジル、イグアスフォールズ
    • Year and Date
      20120620-20120623

URL: 

Published: 2014-07-24  

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