2012 Fiscal Year Research-status Report
口腔角化病変発症メカニズムでのカルボニルタンパクの意義とレドックス抑制機構の解明
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24593003
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
熊谷 章子 岩手医科大学, 歯学部, 助教 (10286594)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 口腔内科学 / 活性酸素 / 酸化ストレス / 口腔扁平苔癬 / 加齢 |
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| Research Abstract |
前癌病変、前癌状態といわれる白板症、口腔扁平苔癬は若年者には認められず、中年～高齢者に多い口腔粘膜疾患である。特に口腔扁平苔癬は発生機序が明らかになっていないため、奏功する治療法が確立されておらず、患者は難治性の粘膜炎に悩まされている。口腔内は特殊な環境下のため、慢性的な炎症を起こす機会が多く、常に酸化ストレスに曝されている。そこでわれわれは加齢に伴う抗酸化作用の低下と酸化損傷分子の蓄積による酸化ストレスの影響について注目した。本研究は加齢による抗酸化作用の減退の影響や活性酸素発生との関連性から、口腔内の病変粘膜から酸化損傷のマーカーであるカルボニルタンパクを検出し、年齢と酸化損傷タンパクの量的および質的相違について調べ、生活習慣や基礎疾患などの全身的要因との関与の検索をし、未だ発生機序が明確でない角化病変発症の原因を証明することを目的としている。健常粘膜と病変部粘膜のカルボニタンパク量の比較を行い、それに加え、血清中、尿中の抗酸化物質・酸化ストレスマーカーの測定値の比較、生活習慣による影響について分析し、口腔粘膜角化病変発症との関与についても検討する。
当該年度は5名の患者および3名の健常者ボランティアより静脈血10ml、尿10mlおよび口腔粘膜組織200mgを採取した。尿からの8-OHdG、血清から抗酸化物質および酸化ストレスマーカーの測定を委託した。試料提供者の喫煙暦、飲酒暦、その他の嗜好物の有無、常用内服薬、基礎疾患など、生活習慣による影響について分析し、口腔粘膜角化病変の酸化損傷と加齢による抗酸化力の減退、酸化損傷分子の蓄積との関与について検討している。また、組織中のカルボニル化タンパクの定量、そしてカルボニル化したタンパクの同定を行うためにタンパク分析のための電気泳動法と、それに続くウエスタンブロット法の適正化を図っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1年間で患者30例および健常者ボランティア30例から静脈血、尿および口腔粘膜組織を採取し、網羅的分析を行う予定であったが、採取試料数が当初の予定に比べ不十分であり、患者と健常者との比較には至っていない。
また、組織中のカルボニル化タンパク同定のためには、まず、口腔粘膜組織試料をホモジナイズし、可溶性タンパクを抽出、次に、カルボニル基は2,4－ジニトロフェニルヒドラジンと容易に脱水縮合するため、ヒドラジン試薬で検出可能なタグが付加されることにより、抗ジニトロフェニル抗体を用いてカルボニル化タンパクを検出するのだが、2次元電気泳動の2次元目SDS-PAGEを12.5％ ポリアクリルアミドゲルで行った後の染色までの実験過程に、試薬調整に伴うと思われるエラーがあり、現在適正実験法を確立するための予備実験中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き前年と同様の方法で試料の収集に勤め、患者および健常者ボランティアより静脈血、尿そして口腔粘膜組織を採取する。血清からは抗酸化物質（ビタミンA・C・E、葉酸、亜鉛、SOD活性）および酸化ストレスマーカー（尿酸、過酸化脂質）を測定、尿から8-OHdGを測定、組織中のカルボニル化タンパクの定量、そしてカルボニル化したタンパクの同定を行う。これらの結果に加え、試料提供者の喫煙暦、飲酒暦、その他の嗜好物の有無、常用内服薬、基礎疾患など、生活習慣による影響について分析し、口腔粘膜角化病変の酸化損傷と加齢による抗酸化力の減退、酸化損傷分子の蓄積との関与について検討する。そして、健常粘膜と病変部粘膜のカルボニルタンパク量の比較を行い、それに加え、血清中、尿中の抗酸化物質・酸化ストレスマーカーの測定値の比較、生活習慣による影響について分析し、口腔粘膜角化病変発症との関与について検討する。
これらの研究結果をもとに、酸化ストレス亢進の機序を解明し酸化還元反応を制御することで、日常で行える効率的なカルボニル生成の抑制方法を探索する。そのために、病変部での反応性カルボニルとそのタンパク修復物の形成・反応経路を解明する。生体にとって有害なカルボニル化合物や、それらの化合物と生体のタンパク質が反応してできた最終産物のうち、ヒドロキシノネナールなどの抗体を使用して、これらの化合物の病変部での局在を、免疫組織化学的に染色して解析し、結果を提示する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
血清、尿中の抗酸化物質、酸化ストレスマーカー測定のための委託費、およびタンパク分析のための試薬購入に使用予定である。
次年度には方法をしっかり確立させ、研究成果の報告発表を学会で行うための旅費と、論文の印刷費に使用を計画している。
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