口腔癌の顎骨浸潤抑制に対してｍＴＯＲ・ＣＯＸ－２による新たな治療法の開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24593007
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 藏口 潤 杏林大学, 医学部, 助教 (30424576)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近津 大地 東京医科大学, 医学部, 教授 (30343122) ; 渡辺 正人 東京医科大学, 医学部, 講師 (40349460) ; 賀来 亨 天使大学, 看護栄養学部, 教授 (60133253) ; 里見 貴史 東京医科大学, 医学部, 准教授 (70276921) ; 池田 哲也 杏林大学, 医学部, 講師 (60424107)
• Keywords: 口腔癌 / mTOR / COX-2 / RANKL

Research Abstract

研究目的：口腔癌の骨破壊・骨浸潤による癌性疼痛は患者のQOLを著しく低下させる。従って、癌の骨への浸潤，あるいは浸潤した癌細胞の骨内での増殖を制御することは臨床上極めて重要な課題である。癌細胞は直接，骨を破壊し進展して行くのではなく，癌により誘発された破骨細胞が活発に骨吸収を起こし，骨吸収によって生じた部分に癌細胞が進展していく。これは骨に特異的な病態であり，骨に対する臓器特異的治療である破骨細胞性骨吸収阻害を中心とした新たな治療が癌の顎骨破壊や骨内での腫瘍増殖を抑制する可能性を示唆している。われわれは口腔扁平上皮癌にしばしば認められる骨破壊・骨浸潤の機序をin vitro, in vivo の実験系を用いて、mammalian target of rapamycin (mTOR)とcyclooxygenase-2 (COX-2)シグナルを介したRANKL の発現の関与を検討する。
平成26年度研究実施計画：　平成25年度研究としてmTOR・COX-2 シグナルによる破骨細胞形成因子RANKL の発現を検討した。すなわち、口腔癌のcell line である２種類のマウス扁平上皮癌細胞（SCCVII, NR-S1）の培養上清（この中にはPTHrP とIL-6 が発現している）をマウス骨髄由来ストローマ細胞株ST2細胞とマウス骨髄細胞の共存培養系に投与し、RANKL のmRNA の発現をRealtime PCR で、タンパクレベルの発現をWestern blot で検討する｡また、mTOR とCOX-2 の関係に対してはmTOR 阻害剤(Temsirolimus)とCOX-2 阻害(Celecoxib, NS-398)を用いて検討する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウスへの癌細胞の生着を考えた場合、ヒト由来細胞よりマウス由来細胞が適していると考え、実験系の再調査として過去の文献を検索しプロトコールを再検討した。まず、マウス扁平上皮癌細胞（SCCVII, NR-S1）の培養継代を行った。55-平方センチメートル dishで、10％FBS、50％units/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンを含む培地中で、37℃、5％CO2条件下で培養したところ、発育状態が悪く培養条件を検討した。その結果、培養条件としてFBSを10％、15％、20％で行ったところ、培養効率が10％FBSで良好であり実験が開始できる状況になった。そして細胞濃度はDMEMで1.0×10５/mlに調整した。しかし条件の設定に苦労し現在まで良好な結果は得られていない。また、培養細胞（SCCVII, NR-S1）からtotal RNAを抽出しCOX-2 mRNAの発現をRT-PCRにより検出したところ発現が得られていない。
よって、本年度前半には条件設定を決定し、研究計画を進める予定である。
その一方、in-vivo での検討をスタートさせた。これは移植担癌マウスの骨浸潤モデル（頭頂骨浸潤モデル、顎骨浸潤モデル）を作製し、当実験に適した骨浸潤モデルを検討しているところである。
研究の進行が遅れているため、平成26年度に平成25年度分の研究も引き続き行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

担癌マウスによる骨浸潤モデルを用いて、骨浸潤・骨転移におけるmTOR およびCOX-2 シグナルの関与を検討する。まず、担癌マウスによる骨浸潤・骨破壊モデルを作成する。次に、マウス扁平上皮癌細胞（SCCVII, NR-S1）(5 × 105 cells/injection)をノックアウトマウスの頭頂骨骨膜下に移植し、移植癌細胞による頭頂骨への浸潤開始時期を検討する。そして、その得られた結果をもとに、移植担癌マウス（頭頂骨浸潤モデル、顎骨浸潤モデル）でmTOR 阻害剤単独群、COX-2阻害剤単独群、mTOR 阻害剤とCOX-2 阻害剤に併用投与群、コントロール群の4群に分け、以下の比較検討を行う。
１）腫瘍体積を（長径）×（短径）2×0.5 および重量から計測　　２）軟X線による骨破壊度の計測　　３）マイクロCT による３次元的形態計測　　４）H-E 染色による病理学的評価と破骨細胞特異的マーカーであるTRAP 染色による破骨細胞数の計測腫瘍組織より産生されるmRNA およびタンパクレベルの発現定量をReal-time PCR にて評価する。IL-6, PTHrP,TNF-α, RANK, RANKL, およびosteoprotegerin のmRNA の発現をReal-time PCR で、タンパクレベルの発現をWestern blot で検討する。試料は、体重を測定してから屠殺後、骨を掃出し、連続縦断切片を作成し、経時的変化を免疫組織学的に解析する。各種染色法により組織学的検討を行う。また、骨芽細胞や破骨細胞の発現様式を検討するために、ALP 染色、TRAP 染色を行う。分化マーカー等を検討するために、タンパクレベルで免疫組織化学的染色を、mRNA レベルではin situ hybridizationを行う。最終的には、統計学的解析を用いて詳細に検討を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成25年度分の研究が遅れているため次年度使用額が生じた。
腫瘍組織より産生されるmRNA （IL-6, PTHrP,TNF-α, RANK, RANKL, およびosteoprotegerin）の発現定量を評価する。
また、試料は、体重を測定してから屠殺後、骨を掃出し、連続縦断切片を作成し、経時的変化を免疫組織学的に解析する。そのために研究費を使用する計画である。