2012 Fiscal Year Research-status Report

顎裂部骨移植における幹細胞を用いた骨組織再生療法の試み―造血系幹細胞の併用―

Research Project

Project/Area Number	24593071
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	松野美乃北海道大学, 歯学研究科(研究院), 専門研究員 (80374544)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	菊入崇北海道大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (10322819) 吉村善隆北海道大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (30230816) 出山義昭北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (80271667) 飯田順一郎北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (90151232)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	歯学 / 再生医学 / 口唇裂・口蓋裂 / 骨移植 / 幹細胞
Research Abstract	本研究では、造血系幹細胞と併用し間葉系幹細胞を用いた唇顎裂・唇顎口蓋裂患者における顎裂部欠損部の骨組織再生療法を確立することを目的としている。本研究は移植した幹細胞の分化転換機構として「間葉幹細胞の骨組織への分化過程において、間葉幹細胞は造血幹細胞と相互作用し、それぞれの分化誘導をコントロールしている。」という仮説を基に間葉系幹細胞による骨組織への分化転換機構明を造血幹細胞との相互作用の観点から明らかにし、また臨床応用へと展開するため、骨形成および骨移植の方法について検討し、形態的にも機能的にも優れた歯槽骨を獲得するための骨組織再生療法に関する基盤的研究を行う。本年度はマウス骨髄より採取・培養した骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）と、骨髄細胞より分離した骨髄由来造血系幹細胞（HSC）を用いて、in vitroおよびin vivoの両面から研究を行った。 In vitroではHSCとMSCの共存培養をおこない、その相互作用を検討した。CFU-F assayを行なった結果、MSC単独の方がHSCとMSCの共存培養よりもコロニー数が有意に多くなった。さらに骨芽細胞分化培地を用いて通法に従い培養した結果、MSC単独での培養とMSCとHSCの共存培養では石灰化に差は認められなかった。 In vitroではMSCとHSCおよび足場をマウス骨欠損部に移植することで骨新生や血管新生が生じるか否か、その量や範囲などの検討を主におこなった。マウス背部皮下およびマウス頭部に骨欠損を生じた部分に細胞と多孔性炭酸含有アパタイトを組み合わせて移植した。HE染色の結果、MSC単独でも骨様組織が形成されたが、MSCとHSCの併用により新生骨の面積が有意に大きくなることが明らかとなった。以上より、MSCとHSCの併用が骨再生療法の効果的な方法になりえることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画に沿って研究はおおむね進んでいると思われる。前年度の現在までの研究結果を基に、今年度は研究のさらなる成果を上げるようにしたい。
Strategy for Future Research Activity	今年度も前年度と同様にマウス骨髄より採取・培養した骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）と、骨髄細胞より分離した骨髄由来造血系幹細胞（HSC）を用いて、in vitroおよびin vivoの両面から研究を行なう。 In vivoでは、引き続きマウス背部皮下およびマウス頭部に骨欠損部を生じた部分にMSCとHSCおよび足場を移植する。マウス飼育日数のバリエーションおよび飼育匹数を増やし追加実験をおこなう。マウスへの移植の数週間後に屠殺し移植体およびその移植体周囲組織を摘出し評価する。移植物の肉眼的、エックス線的評価と組織学的評価をおこなう。組織学的評価では、通法に従い、組織切片をHE染色し、顕微鏡下で観察を行う。また石灰化の状態の評価としてアリザリンレッド染色、免疫染色としてα1(I)collagen、オステオカルシン、オステオポンチンなどの検出を行う。 In vitroではHSCとMSCの共存培養をおこない、その相互作用を検討する。分化培地による骨芽細胞の位相差顕微鏡による形態所見、ALP活性、石灰化の程度を検討する。realtimePCRにて骨芽細胞分化に関与する遺伝子の発現について検討する。western blottingにて各タンパクの発現を検討する。脂肪細胞分化培地を用いて通法に従い培養し、位相差顕微鏡による細胞の形態所見、Oil Red O染色により検討する。軟骨細胞分化培地を用いて通法に従い培養し、細胞の位相差顕微鏡による形態所見およびToluidine Blue染色により検討する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	当該助成金が生じたのは歯学研究科の耐震補強工事が行われ、動物実験施設もその対象となったため、動物飼育数を一時的に減少させたことが原因である。研究計画自体の遅れはないが、今年度減少させた動物実験の数を次年度増加することにより、研究費を使用する予定である。