2012 Fiscal Year Research-status Report
歯周炎罹患歯肉局所におけるアルツハイマー病関連遺伝子の発現亢進を探る
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24593119
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
久保田 健彦 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (50303136)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中曽根 直弘 新潟大学, 医歯学総合病院, 医員 (20447634)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 医療・福祉 / 歯学 / 免疫学 / 病理学 / 遺伝子発現 / タンパク質局在 |
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| Research Abstract |
APP, IL-1beta;, C1QA遺伝子発現レベルの解析
1) 対象者: 新潟大学医歯学総合病院を受診し、重度慢性歯周炎患者と診断されインフォームドコンセントの得られた患者15名 、非歯周炎患者15名。
2) 試料採取: 歯周外科時に歯周ポケット底相当部上皮および結合組織をKubotaらの方法(J Periodontol, 2008)に準じて採取。対照群として、健常者の智歯抜歯時あるいは矯正の便宜抜歯時に炎症のない歯肉を同様に採取し。試料はRNA安定化溶液に24時間浸漬後 (-80℃にて保存する。組織解析用試料は4%PFAに24時間浸漬固定後PBSに保存。
3) qRT-PCR解析: RNA iso(TaKaRa) を用いてtotal RNAを抽出、PrimeScriptTM RT reagent Kit (TaKaRa)を用いた逆転写酵素反応によりcDNAを合成する。cDNAは、-20℃にて凍結保存する。試料の数が十分に確保された後、ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystem Inc)を用いて、APP, IL-1beta;, C1QAについて、特異的プライマーを用いてqRT-PCRを行う。得られた結果はβ-actinで補正し、comparative threshold cycles (Ct法)にて定量する。
免疫組織学的解析：ミクロトームにて5μmに薄切しパラフィン切片を作製し、脱パラフィン、脱水後にヘマトキシリン-エオジン(H-E)染色を行う。免疫染色にはH-E染色した切片の連続切片を用いて、1次抗体に抗APPポリクローナル抗体(Chemicon社)を用いるH-E所見および免疫組織所見は同一部位を写真撮影し、APPの歯肉組織中での局在を解析する。これまで、順調に解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
APP, IL-1beta;, C1QA遺伝子発現レベルの解析
試料のサンプリングは、順調に出来ている。計28サンプルをRNA安定化溶液に24時間浸漬後 -80℃にて保存している。組織解析用試料は良い資料があれば追加サンプリングを予定している。
qRT-PCR解析: これまで28例につき解析済み
免疫組織学的解析：ミクロトームにて5μmに薄切しパラフィン切片を作製し、脱パラフィン、脱水後にヘマトキシリン-エオジン(H-E)染色を行う。免疫染色にはH-E染色した切片の連続切片を用いて、1次抗体に抗APPポリクローナル抗体(Chemicon社)を用いるH-E所見および免疫組織所見は同一部位を写真撮影し、APPの歯肉組織中での局在を解析する。これまで、順調に解析を進めているが、更なるサンプルの追加を予定している。
学会発表：Amyloid beta (A4) precursor protein expression in periodontitis-affected gingival tissuesと題してThe 98th Annual Meeting American Academy of Periodontology in collaboration with the Japanese Society of Periodontology (Research Forum Poster Session) にて途中経過について研究発表を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
必要に応じてqRT-rtPCR、免疫組織化学的解析のサンプル解析を継続・追加する。
結果の評価、解析
A) 分子生物学的解析(qRT-rtPCR) について：１）APP, IL-1beta;, C1QAのCt値をβ-actin 補正し、各々の相対定量値を算出する。２）それらについて、慢性歯周炎群と歯肉増殖症群との群間比較を行う。３）群間比較についてはMann-Whitney U testの後に多重比較を行う。４）統計解析はSPSS 16.0 を用いて行う。また、各検定の有意水準は5%に設定する。
B) 免疫組織化学的解析について：ヘマトキシリン-エオジン染色により炎症状態の評価を行う。免疫組織化学にて、APP, IL-1beta;, C1QAの組織局在を同定し、連続切片上で写真を撮影し、発現細胞数・局在については統計学的に評価を行う。
ｃ）研究成果の発表：以上より得られたデータを用いて、分子生物学的解析及び免疫組織化学の結果が得られた時点で一度まとめ、2013年秋季日本歯周病学会にて発表し、最終的な解析終了後、海外で開催されるアメリカ歯周病学会にて発表し、成果を論文にまとめて国際専門誌に投稿する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
１）分子生物学的解析(qRT-rtPCR) 費については、申請した遺伝子発現解析用試薬、RNA抽出用試薬、cDNA合成用試薬、PCR試薬、プラスチック製品に約400,000円の使用を予定している。
２）免疫組織化学的解析 費については、組織解析用試薬、スライドガラス、カバーガラス、1次抗体、免疫組織化学kitに約450,000円の使用を予定している。
その他、データ保存用消耗品として約200,000円の使用を予定している。
３）研究成果の発表費用として、申請計画に基づき2013年秋季日本歯周病学会発表に約50,000円の使用、アメリカ歯周病学会発表に約約200,000円の使用を予定している。
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