2012 Fiscal Year Research-status Report
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24615004
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
升井 伸治 京都大学, ｉＰＳ細胞研究所, 講師 (20342850)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ES細胞 / 転写因子 / 初期化 / ダイレクトリプログラミング / ポリコーム |
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| Research Abstract |
分化の研究は、いわゆる重要な転写因子（マスターレギュレーター）が同定されると大きく進む。これらを多数同定していけば、理解と応用が進むのだが、任意の細胞でマスターレギュレーターを同定できる手法は無かった。
私はこれまでに、任意の細胞に適用可能とみられる誘導因子（ダイレクトリプログラミング活性をもつ因子）同定法を開発した（iPS干渉法）。解析対象の細胞Ａにおいて、大きな発現変動（iPS誘導）を与える。同時に、その細胞で発現している転写因子を一つ、過剰発現させる。もし、その転写因子が、細胞Ａの発現プロファイル維持に大きな役割を果たすならば、iPS誘導に対する阻害効果（iPSコロニー数の減少；iPS干渉）がみられる。この手法を用いれば、１００因子以上（原理的には全遺伝子）について一因子ずつアッセイし、発現プロファイル維持活性をランク付けすることで、誘導因子をエンリッチできる。実施例として、神経系細胞と肝細胞において、最も強くiPS干渉を起こす因子の中から、誘導因子を同定できた。これらの現象論データから、誘導因子同定に有用と判断していた。しかし、iPS干渉の分子メカニズムが明らかでないために、他の細胞へ適用されていなかった。
そこで本年度は、神経系細胞をモデルとして用いて、山中因子の一つOct3/4と、誘導因子Pax6などについて、ゲノムワイドな結合解析を行った。当初、Oct3/4は、多能性幹細胞特異的遺伝子を活性化する因子だから、神経系細胞では発現の低い遺伝子に結合しているだろうと予想された。ところが意外なことに、Oct3/4は神経系細胞で発現の高い遺伝子に結合していた。Pax6も、神経系細胞で高い遺伝子に結合がみられた。このことから、Oct3/4は神経系細胞の高発現遺伝子を抑制し、Pax6はそれに拮抗すること、これがiPS干渉のメカニズムと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
２４年度中に、iPS干渉の分子メカニズムについて大きな手がかりが得られた。現在のモデルは、以下の通りである。
神経系細胞において、Oct3/4など山中４因子を発現させると、神経系細胞の高発現遺伝子における、プロモーターやエンハンサーに結合する。神経系細胞の高発現遺伝子のこれら制御領域は、Oct3/4が結合すると、その機能が阻害される（Oct3/4の存在下で機能するようになっていないと考えられるからで、立体構造障害などが大きな原因とみられる）。すると、神経系細胞の高発現遺伝子は発現が低下する。神経系細胞の高発現遺伝子は、多くの分化制御因子（developmental regulators）を含んでいる。分化制御因子は、ES細胞においてはポリコーム複合体によって抑制されている。ポリコーム複合体の構成因子遺伝子をノックアウトすると、ES細胞は分化することから、分化制御因子とES細胞の高発現遺伝子は、相互に抑制していると考えられる。すなわち、分化制御因子は、初期化を抑制しているだろう。
神経系細胞の誘導因子は、神経系細胞の高発現遺伝子に結合し、分化制御因子遺伝子の大部分に結合していた。これらの発現を維持していると考えられる。通常の初期化過程の場合には、山中４因子が神経系細胞の高発現遺伝子を抑制できるのだが、神経系細胞の誘導因子を強制発現すると、その強力な発現維持活性によって、発現抑制が阻害されると考えられる。したがって、山中４因子と、神経系細胞の誘導因子が、神経系細胞の高発現遺伝子上で拮抗すること、これがiPS干渉のメカニズムの大きな原因の一つと考えられる。このモデルは、他の細胞においても適用が可能である。実際、繊維芽細胞においては、Oct3/4は繊維芽細胞の高発現遺伝子に結合していた。したがって、当初の計画以上に、iPS干渉のメカニズムについての理解が進んだといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は転写因子機能とエピジェネティック修飾の関係について解析を進める。iPS誘導によって、エピゲノムは完全に転換するが、誘導因子の強制発現によってiPS干渉が引き起こされることから、誘導因子はエピゲノム維持に何らかの役割を果たすといえるだろう。iPS誘導の進行に伴って変化するエピジェネティック修飾を解析するとともに、誘導因子の強制発現によって変化するエピジェネティック修飾を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
前年度に引き続き、細胞培養に用いる培地、プラスチック器具に多く使用する。また、エピジェネティック修飾解析に用いる抗体も購入を予定する。
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