新奇トランスシナプス遺伝子改変技術の開発

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24650175
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 藤本 聡志 独立行政法人理化学研究所, 感覚神経回路形成研究チーム, 研究員 (50586592)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 神経回路形成 / マウス / 遺伝子改変

Research Abstract

神経系は神経細胞がシナプス接続により回路を形成することによって機能することができる。この機能的な回路をシナプス接続特異的に可視化し、さらに遺伝子操作を加えることができれば、これまでにアプローチすることのできなかった接続特異的な神経回路形成の機構やその分子メカニズムを明らかにすることができる。本研究では、膜透過ペプチドとCre-loxPシステムを用いて機能的な神経回路を可視化することに加え、神経回路を接続特異的に遺伝子操作する手法の開発を行うとともに、トランスシナプス遺伝子発現マウスの作製を行うことを目的としている。現在までにいくつかのトランスシナプス遺伝子操作を行うための膜透過性融合タンパク質の設計、発現ベクターを作製、培養系およびin vivoへの遺伝子導入を行った。
(1)TAT融合TEVプロテアーゼとその基質を用いたCreシグナル増幅システムについて、培養系において機能評価を行ったが、TAT融合TEVプロテアーゼの膜透過を確認することができなかった。
(2)子宮内エレクトロポレーション法を用いて、mT/mGマウスの大脳皮質に遺伝子導入を行い交連神経の反対側への投射先におけるシナプス透過性の確認を行うことを試みたが、mT/mGマウスのGFP蛍光が観察困難であったため、適切な評価を行うことが困難であった。
(3)OMPプロモーターの下流にシグナルペプチド、糖鎖付加シグナルを付与したTAT－CRE遺伝子を持つトランスジェニックマウスを作製し、このマウスをmT/mGマウスと交配させたマウスの解析を行ったが、同様にmT/mGマウスのGFP蛍光が検出できず詳細な解析が困難であると考えられた。(2)とともにmT/mGマウスをAi9マウスに変更し再検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究においては、in vivoでのトランスシナプス遺伝子操作技術を確立するための膜透過性融合タンパク質の設計が最重要課題であり、特に時間がかかることはあらかじめ予想されていたが、現段階では、in vivoで機能するシナプス横断可能なタンパク質の作出に成功していないために、若干遅れを生じていると言わざるを得ない。
その理由としては、培養系と実際の神経細胞においては設計した膜透過性タンパク質の挙動が異なること、in vivo評価系に使用する予定であったレポーターマウスがあまり機能的でなかったことが挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

培養細胞系ではうまく機能するコンストラクトであっても、長い神経突起をもつ神経細胞においてはいくつかの点において機能しない可能性が考えられる。神経細胞は細胞内輸送やエンドサイトーシス、エクソサイトーシスにおいて極性を持っており、これらの細胞内機能をうまくハッキングするような修飾が必要であると考えられる。例えば、これまでに順行性輸送されることが知られているタンパク質のシグナルペプチド等を融合するなどして、軸索先端まできちんと輸送されるような設計を行わなければならない。また、神経伝達物質のようにシナプス末端で高効率に放出されるような小胞内に局在する必要もあるので、それらの点について今後検討を行う。現時点で、いくつかの神経成長因子のシグナルペプチドを候補に挙げてクローニングを行っている。。また、in vivoでの評価系についてはmT/mGマウスの代わりにAi9マウスを使用し、これまでに作製したコンストラクトについて再評価を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし