2013 Fiscal Year Annual Research Report
非天然アミノ酸を利用したカルモデュリンキナーゼ２基質同定法の開発
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24650204
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
実吉 岳郎 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (00556201)
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| Keywords | 非天然アミノ酸 / 基質 / リン酸化 |
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| Research Abstract |
カルモデュリンキナーゼ２（CaMKII）は、脳神経系に多く発現する多機能セリンスレオニンリン酸化酵素である。CaMKIIのシナプス可塑性や記憶学習での重要性は、広く知られているにも関わらず、その生理的意義を発現するための直接の標的分子、すなわち基質はほとんど同定されていない。酵素-基質相互作用の多くが一過性の相互作用であるため、一般的な免疫沈降やアフィニティータグによる精製では、同定困難であるものと考えられる。本研究計画は、CaMKIIをモデル分子として光活性化非天然アミノ酸p-benzoil-L-phenylalanine（pBpa）と光活性化型リン酸化酵素という二つの新しい技術を組み合わせ、タンパク質リン酸化酵素の基質を同定する方法論を確立し、CaMKIIのシナプス可塑性における生理的意義の分子神経科学的考察を行うものであった。本年度は、昨年度に使用したフェニルアラニン残基を光活性化型CaMKIIに導入する事を試みた。元の光活性化型CaMKIIのタンパク質収量が非常に悪い為、使用する発現プロモーター、標識タグ、使用コドンの最適化等を行った。結果、ベータアクチンプロモーター、赤色蛍光タンパク質mCherry、が良好な結果が得られた。使用コドンの最適化でヒトコドンを用いたが、顕著な改良は認められなかった。また、光活性化ドメインへ変異を導入して光反応性の改良を試みたが、うまくいかなかった。
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