2012 Fiscal Year Research-status Report
損傷修復におけるＣｅｎｐーＡとＨＪＵＲＰの機能解析
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24651047
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松本 智裕 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (80212223)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | Cenp-A / セントロメア / 損傷修復 |
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| Research Abstract |
Cenp-Aはセントロメア領域に特異的に取り込まれるヒストンH3の派生体であるが、最近の研究により、Cenp-AはDNAの損傷部位にも一過的に取り込まれることが示された。またCenp-Aのセントロメアへの取込みを促進する因子HJURPは、損傷修復過程の中間産物であるホリデージャンクションに結合する。Cenp-AとHJURPとの協調作用が、セントロメアでのクロマチン構築にも損傷修復にも機能することを示唆する。本研究では、セントロメアのクロマチン構築メカニズムと、損傷部位におけるCenp-Aの存在意義を解明することを目的とした。
本年度は分裂酵母モデル系において、Cenp-Aの高発現により生育遅延を起こすもの、あるいはゲノム損傷誘発剤に高感受性を示すものを単離し、一部はその変異部位も同定できた。大変興味深いことに、そのような変異の一つはプロテアソームのサブユニットの一つであるRpt3タンパク質をコードし、この変異体では、セントロメアへのCenp-Aの取込みが亢進することを見出した。その結果、染色体の不安定化し、さらにセントロメア領域における遺伝子サイレンシングが通常よりも強度に起こることも示した。Rpt3を含むタンパク質複合体がヒストンシャペロン様の活性を発揮し、セントロメアにおけるCenp-Aの量を調節していると推測する。このような活性は、損傷部位において修復が完了した後、Cenp-Aを取り除く際にも必要であると考える。
またヒト培養細胞において損傷部位にCenp-Aの取込みが起こることも確認できた。しかしながら、この現象はCenp-Aを高発現したときのみに起こる可能性がある。ヒト培養細胞系では、生理的条件下でCenp-Aの核内分布を観察することは困難であるので、分裂酵母系を用いるべく、アッセイ系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、セントロメアのクロマチン構築メカニズムと、損傷部位におけるCenp-Aの存在意義を解明することを目的とした。このうち、セントロメアのクロマチン構築メカニズムについては、非常に新規性の高い発見があった。すなわち、プロテアソームのサブユニットの一つであるRpt3タンパク質を含むタンパク質複合体がヒストンシャペロン様の活性を発揮し、セントロメアにおけるCenp-Aの量を調節することを示唆する結果である。この点では特段の進歩があったと判断する。
なお損傷部位におけるCenp-Aの存在意義については、現在、生理的条件下（Cenp-Aを高発現しない細胞内）において、Cenp-Aの取込みが起こるか否かを慎重に検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
２４年度に見出したプロテアソームのサブユニットの一つであるRpt3タンパク質を含むタンパク質複合体が、セントロメアへの取込みを促進する因子HJURPと如何に相互作用するかを解明すべきと判断する。このような解析には分裂酵母の遺伝学系が有利である。また、この複合体が有するヒストンシャペロン様の活性の実体も明らかにしたい。ヒストンシャペロンであるFACTやHIRA複合体がプロテアソームと結合することが報告されているので、これらの複合体のセントロメとの相互作用等を検討する。
損傷部位におけるCenp-Aの存在意義については、この存在が生理的条件でも確認出来れば、損傷部位への取込みにおけるHJURPの寄与をリアルタイムで観察し、さらにFRAP法によりGFP-HJURPの動態観察により検討する。またHJURPをRNAi法によりノックダウンし、Cenp-Aの損傷部位への集積効率を解析する。著しく効率が低下すれば、Cenp-Aの集積はHJURP-依存的であると結論できる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
試薬、抗体、培地、使い捨てピペット等、制限酵素等の消耗品を購入する。
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