2012 Fiscal Year Research-status Report
損傷認識を人為的に促進し紫外線ＤＮＡ損傷修復を飛躍的に高める手法の開発
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24651052
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
杉浦 重樹 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (40179130)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森 俊雄 奈良県立医科大学, 医学部, 研究教授 (10115280)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 修復 / CPD |
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| Research Abstract |
核へ移行し、結合することでシクロブタン型ダイマー (CPD) の歪みを大きくする低分子の抗 CPD 抗体を構築するため、抗 CPD モノクローナル抗体産生細胞よりクローニングした重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域 (VL) をペプチドリンカーで繋ぎ、さらに VL のＣ末に SV40 の核移行シグナル (NLS) 続いて His-tag を付加した scFv を作製した。ペプチドリンカーとしては古典的な (G4S)3 及び (G4S)(GGRAS)(G4S)2 の２種類を使用したが、いずれも大腸菌で大量発現させた際、封入体を形成し不溶化した。
封入体を６M塩酸グアニジンで可溶化し、いったんβ―メルカプトエタノールで還元した後に酸化型グルタチオンや L-Arg 存在下塩酸グアニジンを段階透析することで巻き戻しと S-S 結合形成を行い scFv を精製した。この精製した scFv について CPD との結合を ELISA assay で調べたところ、ペプチドリンカーの違いに関係なく、本来の抗体より低下していた。
scFv 化による抗原結合能の低下が見られたので、本来の IgG により近い定常領域の一部を持った Fab 抗体の作製を試みた。VH-CH1-NLS-His-tag 及び VL-CL-NLS-His-tag を各々大腸菌で発現させたところ、scFv 同様封入体を形成し不溶化した。６M塩酸グアニジンで可溶化した両者をモル比１:１で混ぜ、巻き戻しと S-S 結合形成を行ったが、Fab を効率良く精製することは困難であった。
そこで vivo で Fab 形成させる系に切り換え、VH-CH1-NLS-His-tag 及び VL-CL-NLS-His-tag をミエローマ細胞で共発現させるため、分泌型ベクターに各々をクローニングした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
scFv 化した際、抗原認識部位の高次構造が本来のものとは若干異なる場合が有り、その際は抗原との結合能が低下してしまうことがしばしば観察される。VH と VL をつなぐペプチドリンカーを変えたり、あるいは VH と VL の順番を逆転させることで改善される場合もあるが、本課題では２種のリンカーを試したものの違いは見られなかった。可変領域のアミノ酸と定常領域のアミノ酸が相互に関係し尚且つ重鎖と軽鎖が相互作用して高次構造を決定するため、scFv 化して上手く行くかどうか予想するのは困難である。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに作製した VH-CH1-NLS-His-tag 及び VL-CL-NLS-His-tag 発現ベクターをミエローマに co-transfection し、抗 CPD Fab 産生細胞を樹立する。この細胞より分泌された Fab を精製し、以後の実験に使用する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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[Journal Article] Suppressive effect of PARP-1 inhibitor on JC virus replication in vitro2013
Author(s)
Nukuzuma, S., Kameoka, M., Sugiura, S., Nakamichi, K., Nukuzuma, C., Takegami, T.
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Journal Title
J Med Virol
Volume: 85
Pages: 132-137
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Exogenous human immunodeficiency virus-1 protein, Tat, enhances replication of JC virus efficiently in neuroblastoma cell lines2012
Author(s)
Nukuzuma, S., Kameoka, M., Sugiura, S., Nakamichi, K.,Nukuzuma, C., Miyoshi, I., Takegami, T.
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Journal Title
J Med Virol
Volume: 84
Pages: 555-561
DOI
Peer Reviewed
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