多数の１細胞から定量性のある網羅的遺伝子発現情報を取り出すための基盤技術の開発

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24651218
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 笹川 洋平 独立行政法人理化学研究所, 機能ゲノミクスユニット, 基礎科学特別研究員 (10404344)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 1細胞RNA-Seq / トランスクリプトーム / 次世代シーケンサー

Research Abstract

本申請課題では、1細胞RNA-Seq法(SP1: Quartz-Seq)をベースに、定量性を更に向上させつつ、ハイスループット化した1細胞RNA-Seq法(SP2:仮称)を確立することを目的としている。完成を目指すSP2では、PCRとIVT: In vitro transcriptionを組み合わせることにより、増幅後の産物がaRNAとなる。これによりSP2ではハイスループット化のボトルネックになる超音波によるcDNAの断片化のステップを回避することで、ハイスループット化が容易になると期待される。これらに加えて、SP2ではSP1で失っていた転写方向の情報の検出が可能になると期待され、non-coding RNAの1細胞での検出に大きく貢献すると期待される。昨年度はSP2の基盤となる各パラメータの設定に成功した。昨年度設定した条件は３つほどあり、1つめは根本的な改善を図るため1細胞レベルのRNAからの逆転写効率の上昇する要因を3つ特定したこと。２つめはDirectional RNA-Seqを可能とするためのPCRとIVTを組み合わせる最適な条件を2つに絞り込むことに成功したこと。３つめはPCR＆IVT増幅後得られるaRNAから、ハイスループット化のボトルネックであった超音波による断片化なしにシーケンスライブラリ作製方法できるようになったこと。またシーケンスライブラリ作製の効率化にも成功した。5-10 ng のcDNAから非増幅でシーケンスライブラリを作製することができる方法HALprepを作製した。通常の方法ではスタートマテリアルをシーケンスライブラリDNAに変換する効率が1 %程度だが、HALprepでは10 %程度の効率を持っていた。これらパラメータを組み合わせたSP2のプロトタイプはシーケンスによる検証を待つ段階にある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本申請課題では、1細胞RNA-Seq法(SP1: Quartz-Seq)をベースに、定量性を更に向上させつつ、ハイスループット化した1細胞RNA-Seq法(SP2:仮称)を確立することを目的としている。平成24年度計画では、qPCRなどの方法を駆使して、基盤となるSP2のプロトタイプのために必要な増幅法のパラメータ設定を計画していた。平成24年度は、当初の計画通り増幅法の設定を終えた。またシーケンスライブラリ作製法の効率化にも成功し、SP2プロトタイプが完成した。全体としての達成度は約50%。平成24年度当初の計画としてはほぼ計画通りの達成度である。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度は2つのことを推進しようと考えている。一つは計画通り、PCR増幅とIVT増幅を併用するSP2プロトタイプをシーケンスによる検証をすすめ完成を目指すこと。もう一つは、平成24年9月に報告されたハイスループットな方法CEL-Seqで使用されている技術がSP2に応用できないか調べること。CEL-SeqはIVT 増幅のみを使用する1細胞RNA-Seq法で、一人の人が数百の1細胞を同時に扱える可能性をもった非常にスループット性能の高い方法である。一方で、SP1:Quartz-Seqの定量性能には程遠い。当初の計画にはなかったが、CEL-Seqのスループット性能を上昇させる工夫は非常に重要であるので、本申請課題で作製する方法に組み込めないか検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

「該当なし」