2012 Fiscal Year Research-status Report
Ｃａｄｍ１マーカーを利用したホモ接合生殖幹細胞の作製法の確立
| Project/Area Number |
24651223
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
|
| Research Institution | International University of Health and Welfare |
|---|
Principal Investigator |
桃井 隆 国際医療福祉大学, 保健医療学部, 教授 (40143507)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | 生殖幹細胞 / 幹細胞バンク |
|---|
| Research Abstract |
ES細胞、iPS細胞、生殖幹細胞などさまざまな幹細胞が報告されているが、iPS細胞は拒絶反応を回避することが可能であるが、遺伝性疾患の治療には応用できない。移植にマッチするHLAは1/10000であることから、幹細胞治療が広く社会的に利用されるためには、幹細胞バンクの設立が必要である。幹細胞バンクの問題点は、HLAのマッチングする膨大な幹細胞の維持管理にある。減数分裂後の２次精母（卵母）細胞を融合し、ホモ接合した生殖細胞(Spermatogonia)の作製とホモ(接合)生殖幹細胞の作製法の確立を目的とする。Cadm1は申請者が発見したシナプス接着蛋白（RA175/SynCAM1）であるが、精巣では精祖細胞と一次精母細胞に局在し(Fujita et al., 2006)、欠損マウスは精子形成不全をもたらす(Fujita et al., 2008)。
Cadm1を精粗細胞のマーカーとして、Cadm1プロモーターの下流に蛍光タンパクGFPをつなげたBac-Cadm1-GFP-Tgセミノックインマウスを作製し、またJackson Labから、Oct4-GFP-Tgマウスを購入した。作製したBac-Cadm1-GFP-Tgセミノックインマウスは脳と精巣がGFP陽性であった。しかし、GFPはパラホルムアルデヒド固定で、蛍光を消失するばかりか、脳から神経細胞、精巣組織から生殖細胞を単離培養しても、GFPの蛍光が消失し、解析に耐えられなかった。
今後、Cadm1を精粗細胞のマーカーとして、実験計画を遂行するためには、GFPの消失しない条件を確立するか、GFPをRFPに変換する必要がある。今年度、精巣細胞にSrc結合蛋白であるRA70/SKAP2が発現することが明らかになった（投稿準備中）ことから、RA70/SKAP2蛋白をマーカーとすることも考える必要がある。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Cadm1プロモーターの下流に蛍光タンパクGFPをつなげたBac-Cadm1-GFP-Tgセミノックインマウスを作製し、脳と精巣がGFP陽性であることを観察することができた。
しかしながら、GFPはパラホルムアルデヒド固定処理、また脳由来の神経細胞、精巣組織から生殖細胞の単離培養した場合による蛍光の消失に解析に耐えられなかったことが判明し、実験を遂行するためには、固定の条件を検討する必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後、Cadm1を精粗細胞のマーカーとして、実験計画を遂行するために、GFPの消失しない条件を確立するか、GFPをRFPに変換する必要がある。今年度、精巣細胞にSrc結合蛋白であるRA70/SKAP2が発現することが明らかになったことから、RA70/SKAP2蛋白をマーカーとすることも考える。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
GFPの消失しない系として、GFPに変えてmchrrryを用いたマウスを作成する費用にあてる予定である。
電気パルスに使用する消耗品。
細胞分化を観察するための、マーカー抗体に使用する。
|
