ヒト幹細胞分化誘導の時間生物学的制御

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24656495
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 高木 睦 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263212)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 細胞培養 / 時計遺伝子 / 間葉系幹細胞 / 分化 / トランスジェニックラット

Research Abstract

本間研究室で保有しているper2-lucトランスジェニックラットをサクリファイスし、下肢骨の骨髄を培地でフラッシュし、骨髄液を採取した。有核細胞数をカウントし、細胞密度6 x 105 cells/cm2 で、10% FCS DMEM培地を用いて100φディッシュに播種した。播種1 d後にPBS洗浄と培地交換を行い、2 d後および9 d後にも培地交換を行った。再播種後、接着細胞がコンフルエントになったら、細胞（MSC）を剥離し、アンプルに分注し液体窒素中で凍結保存した。
保存したMSCを解凍し、35φディッシュに、播種密度1 x 104 cells/cm2 で播種し、数日間培養しコンフルエントにした。PBS洗浄後、ルシフェリン（10μM）添加した10% FCS DMEM培地に交換し、ルミノメーター付インキュベーター（37℃）に入れて培養するとともに、10分間隔で発光強度を測定した。この結果から、①発光強度が時間経過に応じて振動すること、②振動周期が約25時間であること、③振動が減衰するまでの振動持続時間を確認した。次に、振動が減衰するころに再度培地交換を行い、④振動がさらに持続すること、⑤何回も培地交換を繰り返すことによって最長何時間まで振動を持続できるか、などを調べた。なお、古い培地を取り出して、その培地を培養器に戻す、といった単純な操作では再度の振動は見られず、再振動には培地成分濃度の変化が必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

骨からの骨髄液採取量および骨髄液中の細胞数が予想以上に少なかったため、ラットのサクリファイスを２度繰り返したため、細胞の凍結保存作業の完了に予想以上の時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

MSCの軟骨細胞への分化条件の最適化を早急に行うことにより準備作業を終える。　そして、培地交換による長期間のper2-luc同期培養および非同期培養を同時に並行して行い、両方にサイトカインを添加して軟骨細胞への分化を誘導することにより、per2-luc同期が軟骨分化に及ぼす効果の有無を明らかにする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし