2014 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光相互相関分光法を用いたヒストン修飾クロストークの計測
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24657003
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
木村 宏 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (30241392)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | クロマチン / 染色体 / エピジェネティクス / 翻訳後修飾 / 抗体 / 蛍光相関分光法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンの翻訳後修飾は、遺伝子発現、DNA修復、染色体分配などのゲノム機能の制御と維持に重要な役割を果たしているが、各修飾間のクロストークの全体像は良く分かっていない。本研究は、蛍光標識した二種類の修飾特異的抗体または抗原結合断片（Fab）を用いて、蛍光相互相関分光法（FCCS）により、高感度かつ迅速なヒストン修飾コンビネーション検出法を開発することを目的として行った。Alexa488標識した非修飾型のヒストンH3K4特異的抗体とCy5標識した非修飾型H3K27特異的抗体を用いて条件設定を試みたが、ヒストンが凝集しない条件下では標識抗体が凝集しやすく、また、逆に標識抗体が凝集しやすい条件下ではヒストンが凝集しやすく、溶液中での蛍光相関分光法による計測は容易ではないことが示唆された。IgGの代わりにFabを、また、ヒストンの代わりにヌクレオソームを用いることで、凝集はある程度改善された。しかし、モノヌクレオソームの調製には多くの細胞が必要であり、高感度のヒストン修飾コンビネーションの検出という当初の目的には、この方法は必ずしも向いていないと考えられた。一方、予備的実験として行っていた２種類の蛍光標識Fabを細胞へ導入し、共焦点顕微鏡を用いたアクセプターフォトブリーチングにより共鳴エネルギー移動（FRET）を検出できたことから、このFab用いた生細胞解析法や二重免疫蛍光染色を基盤したFRETの検出により、少数細胞で修飾コンビネーションを評価できると明らかになった。この系を確立させることで、単一細胞レベルで修飾コンビネーションの定量評価が可能になると考えられる。
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