2013 Fiscal Year Annual Research Report
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24657093
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
古川 良明 慶應義塾大学, 理工学部, 准教授 (40415287)
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| Keywords | タンパク質 / 銅イオン / 金属シャペロン |
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| Research Abstract |
本研究では、細胞内での銅イオン輸送について構成論的なアプローチによりその制御メカニズムの解明を試みるために、銅シャペロンのモデルとして出芽酵母由来のCCSタンパク質に着目した。CCSは銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）に銅イオンを輸送するタンパク質である。また、膜タンパク質であるCTR1は、C末端側に存在するドメイン（CTR1C）が細胞質側となるように膜上に配置されていることから、CTR1Cドメインが銅シャペロンとの相互作用を行う部位であると考え、出芽酵母由来のCTR1Cを作製・精製した。精製したCTR1CにCu+イオンを滴下したものの、銅結合型CTR1C（Cu-CTR1C）は得られなかった。CTR1Cは６つのシステイン残基を配位子として、４つのCu+イオンを結合することが示唆されている。しかし、電気泳動法による解析の結果、精製したCTR1Cのシステイン残基は酸化されてジスルフィド結合を形成し、多量体として存在していることが分かった。そこで、CTR1Cに形成したジスルフィド結合を効率よく還元する手法を確立し、得られた還元型CTR1CにCu+イオンを滴下すると、約４当量のCu+イオンを結合したCu-CTR1Cを作製できることが、分光学的手法により明らかとなった。Cu-CTR1CからCCSへの銅イオン移動は、既報に従い作製したアポ型のCCS（apo-CCS）とCu-CTR1Cを混合し、37 oCで１時間インキュベートすることで検討した。反応後、CCSとCTR1Cをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、CCSを含む分画について、タンパク質及び銅イオンの比色定量を行った結果、CCSは銅イオンを結合していることが分かった。Apo-CTR1Cとapo-CCSを混合した場合や、apo-CCSのみを用いた際には、銅イオンが検出されなかったことから、CTR1Cに結合したCu+イオンがCCSに移動したと考えられる。
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