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2013 Fiscal Year Annual Research Report

細胞内タンパク質の微小な構造変化を可視化する手法の開発

Research Project

Project/Area Number 24657101
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

今村 博臣  京都大学, 白眉センター, 准教授 (20422545)

Keywordsバイオセンサー / 抗体 / アセチルCoA / 蛍光タンパク質
Research Abstract

微小なタンパク質の構造変化を識別する抗体を用いたアセチルCoAのFRETバイオセンサーの開発を目指した。前年度までに、グリホサートアセチル転移酵素(GAT)のアセチルCoA結合状態を識別する一本鎖抗体(scFv)を得た。そこで、最終年度では、GATとscFvおよび2種類の蛍光タンパク質が1本のポリペプチドとして作られるよう組換え遺伝子を作製した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、さらに産物である人工融合タンパク質を精製した。次に、精製タンパク質の蛍光スペクトルを蛍光分光器を用いて解析した。その結果、GATに結合するscFvを用いた際には、結合しないscFvを用いた場合と比べ、FRET効率は大幅に上昇していた。しかし、GATに結合するscFvを用いた人工融合タンパク質のFRET効率は、アセチルCoAの有無で変化せず、常に高いFRET効率を示した。これは、このscFvがアセチルCoAに結合していないGATに対しても弱いながら結合能を有しているためだと考えられた。並行して、最もFRET効率が高くなるGAT、scFv(VH + VL)および蛍光タンパク質の並びを検討した。その結果、YFP-VH-VL-YFP-GATの並びとなった時に、最もFRET効率が高くなることを見出した。scFvやGATあるいは両者を繋ぐリンカー配列に変異を導入してGATとscFvの相互作用を減らすことにより、アセチルCoAに応答してFRET効率の変化を可能にで出来ると考えられた。

  • Research Products

    (12 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Evaluation of intra-mitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation2014

    • Author(s)
      Kioka, H, Kato, H, Fujikawa, M, Tsukamoto, O, Suzuki, T, Imamura, H, Nakano, A, Higo, S, Yamazaki, S, Matsuzaki, T, Takafuji, K, Asanuma, H, Asakura, M, Minamino, T, Shintani, Y, Yoshida, M, Noji, H, Kitakaze, M, Komuro, I, Asano, Y, Takashima, S
    • Journal Title

      Proc Natl Acad Sci U S A

      Volume: 111(1) Pages: 273-8

    • DOI

      10.1073/pnas.1318547111

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Glucose-stimulated single pancreatic islets sustain increased cytosolic ATP levels during initial Ca2+ influx and subsequent Ca2+ oscillations2014

    • Author(s)
      Tanaka, T, Nagashima, K, Inagaki, N, Kioka, H, Takashima, S, Fukuoka, H, Noji, H, Kakizuka, A, Imamura, H
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 289 Pages: 2205-2216

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.499111

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ATP increases within the lumen of the endoplasmic reticulum upon intracellular Ca2+-release2014

    • Author(s)
      Vishnu, N, Jadoon Khan, M, Karsten, F, Groschner, LN, Waldeck-Weiermair, M, Rost, R, Hallström, S, Imamura, H, Graier, WF, Malli, R
    • Journal Title

      Molecular Biology of the Cell

      Volume: 25 Pages: 368-379

    • DOI

      10.1091/mbc.E13-07-0433

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Genetically encoded fluorescent thermo-sensors for visualizing subcellular thermoregulation in living cells2013

    • Author(s)
      Kiyonaka, S, Kajimoto, T, Sakaguchi, R, Shinmi, D, Omatsu-Kanbe, M, Matsuura, H, Imamura, H, Yoshizaki, T, Hamachi, I, Morii, T, Mori, Y
    • Journal Title

      Nature Meth

      Volume: 10(12) Pages: 1232-8

    • DOI

      10.1038/nmeth.2690

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Role of PFKFB3-driven glycolysis in vessel sprouting2013

    • Author(s)
      De Bock, K, Georgiaudou, M, Schoors, S, Kuchnio, A, Rita Cantelmo, A, Wong, RW, Quaegebeur, A, Ghesquiére, B, Cauwehberghs, S, Eelen, G, Phng, LK, Betz, I, Tembuyser, B, Brepoels, K, Welti, J, Geudens, I, Segura, I, Cruys, B, Bifari, F, Decimo, I, Blanco, R, Wyns, S, Vangindertael, J, Rocha, S, Collins, R, Munck, S, Daelemans, D, Imamura, H, Devlieger, R, Rider, M, Van Veldhoven, PP, Schuit, F, Bartrons, R, Hofkens, J, Fraisi, P, Telang, S, DeBerardinis, RJ, Schoonjans, L, Vinckier, S, Chesney, J, Gerhardt, H, Dewerchin, M, Carmeliet, P
    • Journal Title

      Cell

      Volume: 154(3) Pages: 651-63

    • DOI

      10.1016/j.cell.2013.06.037

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] In vivo fluorescent adenosine 5’-triphosphate (ATP) imaging of Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans by using a genetically encoded fluorescent ATP biosensor optimized for low temperatures2013

    • Author(s)
      Tsuyama, T, Kishikawa, J, Han, YW, Harada, Y, Tsubouchi, A, Noji, H, Kakizuka, A, Yokoyama, K, Uemura, T, Imamura, H.
    • Journal Title

      Analytical Chemistry

      Volume: 85 Pages: 7889-7896

    • DOI

      10.1021/ac4015325

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 蛍光ATPバイオセンサーを用いたATP代謝の解析

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第50回日本臨床分子医学会学術集会
    • Place of Presentation
      東京国際フォーラム
    • Invited
  • [Presentation] 蛍光ATPバイオセンサーATeamを用いた膵島エネルギー代謝の解析

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第13回Islet Biology 研究会
    • Place of Presentation
      日本都市センターホテル
    • Invited
  • [Presentation] ATPイメージングによる生細胞内ミトコンドリア機能の評価

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      日本生化学会第86回年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Invited
  • [Presentation] 膵臓ランゲルハンス島におけるATPとCa2+の同時イメージング

    • Author(s)
      田中喬、今村博臣
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会 第39回討論会
    • Place of Presentation
      静岡県コンベンションアーツセンター
  • [Presentation] 膵臓ランゲルハンス島におけるATPとCa2+の同時イメージング

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第3回 発生におけるエネルギー代謝を考える会
    • Place of Presentation
      熊本大学
  • [Remarks] インスリン分泌における重要因子が変動する様子を可視化

    • URL

      http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/h1/news6/2013_1/140130_2.htm

URL: 

Published: 2015-05-28  

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