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2012 Fiscal Year Research-status Report

小胞体トランスロコンでのタンパク質輸送の一分子解析

Research Project

Project/Area Number 24657106
Research InstitutionUniversity of Hyogo

Principal Investigator

阪口 雅郎  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (30205736)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywordsシグナル配列 / 膜タンパク質 / 小胞体
Research Abstract

小胞体トランスロコンを通した新生ポリペプチド鎖輸送の一分子観察を目指して、実験系の設定を進め下記の成果を得た。
【1】イヌ膵臓より調製した粗面小胞体を添加した、タンパク質合成・膜透過無細胞実験系を効率化した。【2】無細胞実験系によって、小胞体トランスロコンでの新生ポリペプチド鎖の膜透過に対して、コレステロールが多面的な阻害作用を示すことを明らかにした。リン脂質二重層に存在するコレステロールはシグナル配列によるトランスロコン標的化を部分的に抑制するばかりではなく、リボソームが小胞体に標的化した後にもトランスロコンでの正電荷の動きを抑制することを見出した。逆にポリペプチド鎖上の疎水性配列は動きが促進された。疎水性配列に対する動き促進作用は、コレステロールによるトランスロコンチャネルの横方向への開放の阻害と考えられた。一分子解析系の膜成分の最適化およびトランスロコンの機能調整機構について重要な知見である。【3】小胞体でのタンパク質膜透過に対して、負電荷リン脂質であるフォスファチジルセリン結合タンパク質ラクトアドヘリンが阻害作用を示すことを見出した。【4】小胞体におけるポリペプチド鎖の動きを解析する中で、膜結合リボソームが新生鎖を迅速に遊離するためには、伝令RNAの終止コドンの後方に10塩基以上のRNA配列が必要であることを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

無細胞タンパク質合成系の合成効率を向上させ、コレステロール組成の効果を発見し、リボソームの作用に必要な伝令RNAの非翻訳領域の寄与を明らかにした。一方、一分子観察に必要な、新生ポリペプチド鎖の蛍光ラベル系の構築にまで到達できていない。蛍光ラベル産物の検出に不可欠な高感度検出装置が稼動し始めたが、蛍光ラベルを有する非天然アミノ酸を結合したtRNAの作成方策の策定に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

蛍光ラベルされた非天然アミノ酸を有するtRNAの作成に集中的に取り組み、SDS-電気泳動後に蛍光分析装置で検出可能な量の新生鎖の合成条件を設定する。さらに、溶液条件とエバネッセント蛍光顕微鏡による固定場条件での検出条件を最適化する。さらに、小胞体でのポリペプチド鎖の輸送駆動要因解明に向けて小胞体内腔因子の同定と、一分子観察系による機能解析を目指す。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

無細胞タンパク質合成・膜透過実験、蛍光ラベルアミノ酸-tRNAの合成条件至適化のための物品の購入に充てる。

  • Research Products

    (16 results)

All 2013 2012

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (12 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Tail-extension following the termination codon is critical for release of the nascent chain from membrane-bound ribosomes in a reticulocyte lysate cell-free system2013

    • Author(s)
      Takahara, M., Sakaue, H., Onishi, Y., Yamagishi, M., Kida, Y., and Sakaguchi, M.
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: 430 Pages: 567-572

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2012.11.112

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Phosphatidylserine-binding protein lactadherin inhibits protein translocationacross the ER membrane2013

    • Author(s)
      Yamamoto, H., Kida, Y., and Sakaguchi,M.
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: in press Pages: 未定

    • DOI

      doi:pii: S0006-291X(13)00610-4. 10.1016/j.bbrc.2013.03.131

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Pleiotropic effects of membrane cholesterol upon translocation of protein across the endoplasmic reticulum membrane2012

    • Author(s)
      Yamamoto, H., Fujita, H., Kida, Y. and Sakaguchi, M.
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 51 Pages: 3596-3605

    • DOI

      10.1021/bi2018915

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A cis-acting five-amino acid motif controls targeting of ABCC2 to the apical plasma membrane domain2012

    • Author(s)
      Emi, Y., Yasuda, Y. and Sakaguchi, M.
    • Journal Title

      J. Cell Sci.

      Volume: 125 Pages: 3133-3143

    • DOI

      10.1242/jcs.099549

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ABCC1のbasolateral側細胞膜への極性局在化を制御するシグナルの解析2012

    • Author(s)
      衣斐義一、原田泰江、阪口雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 細胞内での小胞体トランスロコンにおけるタンパク質膜透過の一時停止を解析する2012

    • Author(s)
      姜 公秀、高原教代、大西由希子、藤田英伸、木田祐一郎、阪口 雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンにおけるポリペプチド鎖膜透過の速度論:少数の正電荷による膜透過減速効果2012

    • Author(s)
      大西由希子、山岸麻里芙、藤田英伸、木田祐一郎、阪口雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 膜タンパク質の小胞体標的化を抑制するアミノ末端モチーフの解析2012

    • Author(s)
      阪上春花、岩下昌平、木田祐一郎、阪口雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 小胞体膜トランスロコンにおいて正電荷アミノ酸により引き起こされるポリペプチド鎖の逆方向への動き2012

    • Author(s)
      藤田英伸、木田祐一郎、阪口雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] リボソーム-トランスロコン複合体における疎水性配列の識別機構2012

    • Author(s)
      木田祐一郎、石原裕大、藤田英伸、阪口雅郎
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンを介したポリペプチド鎖の動き2012

    • Author(s)
      藤田英伸、木田祐一郎、阪口雅郎
    • Organizer
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場(愛知県)
    • Year and Date
      20120620-20120622
  • [Presentation] リボソームは小胞体トランスロコンを介した膜貫通セグメントの形成を制御する2012

    • Author(s)
      大西由希子、山岸麻里芙、藤田英伸、木田祐一郎、阪口雅郎
    • Organizer
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場(愛知県)
    • Year and Date
      20120620-20120622
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンを介した膜タンパク質の構造形成2012

    • Author(s)
      木田祐一郎、矢吹隆明、藤田英伸、阪口雅郎
    • Organizer
      第12回日本蛋白質科学会年会ワークショップ「in vivo 蛋白質科学:構造形成と分解」
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場(愛知県)
    • Year and Date
      20120620-20120622
    • Invited
  • [Presentation] 小胞体トランスロコンを介した新生ポリペプチド鎖の動きの制御2012

    • Author(s)
      Sakaguchi, M.
    • Organizer
      第12回日本蛋白質科学会年会シンポジウム「細胞内のタンパク質動態と細胞機能: Protein dynamics and cellular functions」
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場(愛知県)
    • Year and Date
      20120620-20120622
    • Invited
  • [Presentation] Analysis of N-terminal motif suppressing ER-targeting2012

    • Author(s)
      Sakaue, H., Iwashita, S., Yuichiro Kida, Y., and Sakaguchi, M.
    • Organizer
      第45回日本発生生物学会・第64回日本細胞生物学会合同大会
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場(兵庫県)
    • Year and Date
      20120529-20120531
  • [Presentation] Distinct cis-acting determinants in the first cytoplasmic loop domain control apicobasal distribution of the ATP-binding cassette transporter family C isoforms2012

    • Author(s)
      Emi, Y. and Sakaguchi, M.
    • Organizer
      第45回日本発生生物学会・第64回日本細胞生物学会合同大会
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場(兵庫県)
    • Year and Date
      20120529-20120531

URL: 

Published: 2014-07-24  

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